Konfokales Laser Scanning-Mikroskop mit Spinning Disc-Technologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Arbeitskreis Hartwig: Der Arbeitskreis Hartwig beschäftigt sich mit dem Einfluss essentieller Spurenelemente, toxischer Metallverbindungen und bioaktiver Lebensmittelinhaltsstoffe auf die Stabilität des Genoms. Live cell imaging (LCI) wurde einerseits zur Aufklärung des Einflusses toxischer Metallverbindungen auf DNA-Reparaturprozesse, speziell der Anlagerung spezifischer DNA-Reparaturproteine an die Schadensstelle, und andererseits zum Nachweis der Aufnahme und intrazellulären Lokalisation von metallhaltigen Nanopartikeln eingesetzt. Einfluss toxischer Metallverbindungen auf DNA-Reparaturprozesse: Ausgehend von einer Hemmung der DNA-Doppelstrangbruchreparatur durch Antimon wurde ein LCI-basierter Ansatz in GFP-53BP1 transfizierten U2OS Zellen entwickelt. Ziel war es, anhand des Auftretens und Verschwindens von GFP-53BP1 den Einfluss auf die Homologe Rekombination zu verfolgen. Es zeigte sich, dass Antimon die Anlagerung von 53BP1 deutlich inhibiert und somit die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen in Richtung des wesentlich fehlerhafteren Nicht-homologen End-Joinings (NHEJ) verschiebt. Untersuchungen mit weiteren Metallverbindungen laufen derzeit. Bezüglich des Einflusses toxischer Metallverbindungen auf die Nucleotid-Exzisionsreparatur wurden Zellen mit einem GFP-XPA Vektor transfiziert und nach UVC-Bestrahlung die Anlagerung und Dissoziation in Gegenwart von Nickel über mehrere Stunden in guter Auflösung verfolgt. Zelluläre Aufnahme und intrazelluläre Verteilung von Quantum Dots sowie metallbasierter Nanopartikel: Um die Aufnahme und intrazelluläre Verteilung von Quantum Dots (QD) sowie metallbasierter Nanopartikel zu untersuchen wurden zunächst verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe zur gezielten Markierung bestimmter Zellkompartimente (Zellmembran, Mitochondrien, Lysosomen, Zellkern) ausgewählt. Die Untersuchungen ergaben eine zeitabhängige Aufnahme sowie eine Kolokalisation der Partikel mit Lysosomen; zudem konnte die räumliche Anordnung dieser Organellen innerhalb der Zelle beobachtet werden. Arbeitskreis Fischer: Der Arbeitskreis Fischer arbeitet mit Aspergillus nidulans (A. nidulans) als Modell für die eukaryotische Entwicklung und Zellbiologie. Organisation des Mikrotubuli Cytoskeletts und die Rolle im polaren Wachstum - Zellend-Markerproteine: Ein Projekt, in dem eine schnelle Bildaufnahme mit hervorragender Auflösung nötig ist, beschäftigt sich mit der Funktion von sogenannten Zellend-Markerproteinen. Diese Proteine markieren das wachsende Hyphenende. AK Fischer hat mit TeaR ein Protein entdeckt, das durch einen Prenylrest an der Cytoplasmamembran verankert ist. Dieses Protein rekrutiert einen Proteinkomplex und schließlich Formin (SepA), das Aktinfilamente bildet. AK Fischer konnte eine Interaktion des Mikrotubulus-Plusendproteins AlpA mit dem Zellendmarkerprotein TeaA nachweisen. Diese Interaktion reguliert offensichtlich die Dynamik der Mikrotubuli und führt zu einem Stopp des Wachstums, wenn der Mikrotubulus das Zellende erreicht. Dies konnte sehr schön in in vitro Mikrotubulipolymerisationsexperimenten bestätigt werden. Die Zellendmarkerproteine TeaA und TeaR werden durch wachsende Mikrotubuli zur Zellspitze befördert. Im Vergleich dazu wird in Schizosaccharomyces pombe zunächst ein Kinesinmotor eingesetzt, um die Proteine an die Enden der Mikrotubuli zu transportieren. Ein Homologes dieses Kinesins, KipA, ist in A. nidulans nicht nötig. Allerdings gibt es Hinweise, dass neue Zellendmarkerproteine durch diesen Motor transportiert werden, die die Lokalisierung von TeaA und TeaR gewährleisten. Um diese neuen Proteine als Cargoes von KipA aufzufinden, führte AK Fischer einen Yeast-Two-Hybrid-Ansatz durch. Dabei wurden vier neue Proteine als Interaktionspartner identifiziert. Die Untersuchung der Zellendmarkerproteine hat einen Zusammenhang mit Membrandomänen ergeben. Durch hochauflösende Mikroskopie ist es uns gelungen, die dynamischen Vorgänge an der Hyphenspitze zu charakterisieren. Außerdem wurde ein neues Protein, welches an Mikrotubulus-Plusenden lokalisiert, charakterisiert. Es ist für die corticale Interaktion der Mikrotubuli verantwortlich.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2015). Genetic evidence for a microtubule-capture mechanism during polar growth of Aspergillus nidulans. J. Cell Sci.
Manck, R., Ishitsuka, Y., Herrero de Vega, S., Takeshita, N., Nienhaus, U.G. & Fischer, R.
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(2015). Live cell imaging of endosomal trafficking in fungi. Meth. Mol. Biol.
Baumann, S., Grün, N., Takeshita, N., Fischer, R. & Feldbrügge, M.
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(2015). Super-resolution microscopy reveals a dynamic picture of cell polarity maintenance during directional growth. Science Advances
Ishitsuka, Y., Savage, N., Li, Y., Bergs, A., Kohler, D., Donnelly, R., Nienhaus, U., Fischer, R. & Takeshita, N.
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(2015). The Rab GTPase YPT-1 associates with Golgi cistern and Spitzenkörper micro vesicles in Neurospora crassa. Mol. Microbiol.
Sánchez-León, E., Bowman, B., Seidel, C., Fischer, R., Novick, P. & Riquelme, M.
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(2015). Transportation of Aspergillus nidulans class III and V chitin synthases to the hyphal tips depends on conventional kinesin. PLoS One
Takeshita, N., Wernet, V., Tsuizaki, M., Grün, N., Hoshi, H., Ohta, A., Fischer, R. & Horiuchi, H.
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(2016). Dynamics of Actin Cables in Polarized Growth of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans. Frontiers in Microbiology
Bergs, A., Ishitsuka, Y., Evangelinos, M., Nienhaus, G.U. and Takeshita, N.
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(2016). Fungi use the SakA/HogA pathway for phytochrome-dependent light signaling. Nature Microbiol.
Yu, Z., Armant, O. & Fischer, R.
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(2017). Low concentrations of antimony impair DNA damage signaling and the repair of radiation-induced DSB in HeLa S3 cells. Archives of Toxicology
Koch, B., Maser, E. and Hartwig A.
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(2017). Microbutule-organizing centers of Aspergillus nidulans are anchored at septa by a disordered protein. Mol. Microbiol.
Zhang, Y., Gao, X. Manck, R. Schmid, M., Osmani, A.H., Osmani, S.A., Takeshita, N. & Fischer, R.
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(2017). Pulses of Ca2+ coordinate actin assembly and exocytosis for stepwise cell extension. Proc. Natl. Acad. Sci.
Takeshita, N., Evangelinos, M., Zhou, L., Somera-Fajardo, R.A., Lu, L., Takaya, N., Nienhaus, G.U. & Fischer, R.
