Laser Scanning-Fluoreszenzmikroskop mit Stimulated Emission Depletion (STED)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das STED Mikroskop eignet sich zum einen hervorragend für Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie im konventionellen Konfokal-Modus. Hier kann durch den Weißlichtlaser in kleinen Abstufungen die optimale Anregungswellenlänge bestimmt werden, durch die beiden HyD Detektoren ist auch in Bakterien mit Proteinen in geringer Stückzahl effiziente Fluoreszenzmikroskopie möglich. Im konfokalen Modus ist es uns gelungen, in mehreren Projekten parallel CFP und YFP Fluoreszenz zeitaufgelöst zu mikroskopieren, und dadurch die Dynamik zweier Proteine relativ zueinander zu verfolgen. In drei Projekten mit Membranproteinen konnten hier räumlich-dynamische Prozesse aufgelöst werden, die zum Verständnis der Funktion der Proteine essentiell waren. Den superauflösenden STED Modus haben wir vor allem in 3 Projekten verwendet. In zwei Projekten konnte die Größe von Assemblierungen von Membranproteinen (vor allem von Flotillinen) und von Membran-assoziierten Proteinen (Bactofiline) bestimmt werden. Im dritten Projekt konnte die Struktur von MreB Filamenten mit 42 nm Auflösung bestimmt werden. Wir waren in der Lage, auch die Breite von MreB Filamenten in lebenden Zellen zu bestimmen und damit zu zeigen, dass es sich um flache Anordnungen von 14 Protofilamenten und mehr handelt. Zur Zeit visualisieren wir MreB Filamente in vitro auf einer flachen Membran, auch hier kann durch STED Mikroskopie die Breite bzw. der Durchmesser von Filamentbündeln bestimmt werden. Das Mikroskop hat sich als generelles Routinemikroskop bewährt, und kann durch den STED Modus bis knapp 40 nm Strukturen auflösen, die bei konventioneller Fluoreszenzmikroskopie keine definierten Aussagen zulassen. Der Sprung von 250 auf unter 50 nm ist ein enormer Zugewinn für die Zellbiologie.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2013) Motion of variablelength MreB filaments at the bacterial cell membrane influences cell morphology. Mol. Biol. Cell 24: 2340-2349
Reimold, C., H.-J. Defeu Soufo, F. Dempwolff and P. L. Graumann
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(2014) Polar localization of a tripartite complex of the twocomponent system DcuS/DcuR and the transporter DctA in Escherichia coli depends on the sensor kinase DcuS. PLOS One 30, e115534
Scheu, PD, Steinmetz, PA, Dempwolff, F, Graumann, PL, Unden, G
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(2014) Progress towards Bioorthogonal Catalysis with Organometallic Compounds. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53, 10536-10540
Völker T, Dempwolff F, Graumann PL, Meggers E.
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(2015) Bacillus subtilis bactofilins are essential for flagellar hook- and filament assembly and dynamically localize into structures of less than 100 nm diameter underneath the cell membrane. PLOS One 10:e0141546
El Andari, J, Altegoer, F, Bange, G, Graumann PL
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(2015) Bioorthogonal Enzymatic Activation of Caged Compounds. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54: 13440-13443
Ritter C, Nett N, Acevedo-Rocha CG, Lonsdale R, Kräling K, Dempwolff F, Hoebenreich S, Graumann PL, Reetz MT, Meggers E
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(2015) MinD-like ATPase FlhG effects location and number of bacterial flagella during C-ring assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 112: 3092-3097
Schuhmacher JS, Rossmann F, Dempwolff F, Knauer C, Altegoer F, Steinchen W, Dörrich AK, Klingl A, Stephan M, Linne U, Thormann KM, Bange G
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(2016) Super Resolution Fluorescence Microscopy and Tracking of Bacterial Flotillin (Reggie) Paralogs Provide Evidence for Defined-Sized Protein Microdomains within the Bacterial Membrane but Absence of Clusters Containing Detergent- Resistant Proteins. PLoS Genet. 12(6):e1006116
Dempwolff F, Schmidt FK, Hervás AB, Stroh A, Rösch TC, Riese CN, Dersch S, Heimerl T, Lucena D, Hülsbusch N, Stuermer CA, Takeshita N, Fischer R, Eckhardt B, Graumann PL
