Laser Scanning-Fluoreszenzmikroskop mit Stimulated Emission Depletion (STED)
Final Report Abstract
Das STED Mikroskop eignet sich zum einen hervorragend für Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie im konventionellen Konfokal-Modus. Hier kann durch den Weißlichtlaser in kleinen Abstufungen die optimale Anregungswellenlänge bestimmt werden, durch die beiden HyD Detektoren ist auch in Bakterien mit Proteinen in geringer Stückzahl effiziente Fluoreszenzmikroskopie möglich. Im konfokalen Modus ist es uns gelungen, in mehreren Projekten parallel CFP und YFP Fluoreszenz zeitaufgelöst zu mikroskopieren, und dadurch die Dynamik zweier Proteine relativ zueinander zu verfolgen. In drei Projekten mit Membranproteinen konnten hier räumlich-dynamische Prozesse aufgelöst werden, die zum Verständnis der Funktion der Proteine essentiell waren. Den superauflösenden STED Modus haben wir vor allem in 3 Projekten verwendet. In zwei Projekten konnte die Größe von Assemblierungen von Membranproteinen (vor allem von Flotillinen) und von Membran-assoziierten Proteinen (Bactofiline) bestimmt werden. Im dritten Projekt konnte die Struktur von MreB Filamenten mit 42 nm Auflösung bestimmt werden. Wir waren in der Lage, auch die Breite von MreB Filamenten in lebenden Zellen zu bestimmen und damit zu zeigen, dass es sich um flache Anordnungen von 14 Protofilamenten und mehr handelt. Zur Zeit visualisieren wir MreB Filamente in vitro auf einer flachen Membran, auch hier kann durch STED Mikroskopie die Breite bzw. der Durchmesser von Filamentbündeln bestimmt werden. Das Mikroskop hat sich als generelles Routinemikroskop bewährt, und kann durch den STED Modus bis knapp 40 nm Strukturen auflösen, die bei konventioneller Fluoreszenzmikroskopie keine definierten Aussagen zulassen. Der Sprung von 250 auf unter 50 nm ist ein enormer Zugewinn für die Zellbiologie.
Publications
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