Gerichtete Evolution von Riboschaltern in Säugerzellen zur externen Kontrolle der Expression therapeutischer Gene

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Dirk M. Nettelbeck
• Fachliche Zuordnung: Dermatologie ; Hämatologie, Onkologie ; Virologie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 230774252

Der therapeutische Gentransfer ist eine vielversprechende Strategie zur Behandlung von Krebserkrankungen. Dazu werden replikationsdefekte und zuletzt auch replikationsfähige/onkolytische Viren als Gentransfervektoren eingesetzt. Letztere verbinden eine Tumorzelllyse mit der Amplifikation des eingesetzten Gens. Insbesondere für replizierende Vektoren ist eine externe Kontrolle der Expression des therapeutischen Gens von Vorteil oder sogar erforderlich. Sie ermöglicht eine Dosierung und zeitliche Kontrolle der Genexpression und dient als Sicherheitsmaßnahme. Wir untersuchen artifizielle Aptazyme, ligandenabhängige Ribozyme, als innovative Methode zur Regulation der therapeutischen Genexpression. Diese kurzen Sequenzen zeigen RNA-intrinsische, selbst-spaltende Aktivität, sind unabhängig von Protein-Nukleinsäure-Interaktionen und nicht immunogen. Dies sind wesentliche Vorteile gegenüber den häufig eingesetzten Promotoren, für die auch ein Verlust der Regulation bei hohen Kopienzahlen beschrieben wurde, z.B. in onkolytischen Viren. Mit einem Modellaptazym haben wir kürzlich die Positionierung in Transkriptionseinheiten optimiert und gezeigt, dass deren Aktivität zur Genabschaltung in replikationsdefekten und onkolytischen Viren, unabhängig von der Virusstreuung, erhalten bleibt. Dieses Modellaptazym besitzt zuvor unerreichte, jedoch immer noch zu geringe Induktionsraten in Säugerzellen. Erstes Ziel des Projektes ist es daher, durch gerichtete Evolution AUS- und auch AN-schaltende Aptazyme mit hohen Induktionsraten in Säugerzellen zu entwickeln. Dazu werden wir hochdiverse Aptazymbibliotheken zur Kontrolle der Koexpression von GFP und eines Suizidgens herstellen. Effektive Aptazyme werden durch sequenzielle Positivselektion (GFP) und Negativselektion (Prodrug-Aktivierung) stabil transduzierter Zellen in An- oder Abwesenheit verschiedener Liganden isoliert, sequenziert und in Transfektionsstudien charakterisiert. Zweites Ziel des Projektes ist es mit optimierten Aptazymen die Expression tumorspezifisch zytotoxischer Liganden in onkolytischen Adenoviren (OAd) zu kontrollieren. Dazu untersuchen wir den natürlichen Todesliganden TRAIL sowie ImmunRNasen, die eine parakrine und durch die austauschbare Antikörperdomäne tumorspezifische Zytotoxizität besitzen. Kürzlich konnten wir zeigen, dass eine funktionelle Expression von ImmunRNasen durch OAds prinzipiell möglich ist. Allerdings ist eine Genregulation erforderlich, um die von uns beobachtete Minderung der Virusreplikation zu umgehen. Deshalb werden wir die Regulation der Expression von EGFR-gerichter ImmunRNase und von TRAIL durch optimierte Aptazyme untersuchen. Letztlich werden wir eine Kombinationstherapie aus Onkolyse und induzierbaren zytotoxischen Liganden in Zellkultur und Tiermodellen etablieren. Unser Projekt wird somit Riboschalter mit herausragendem Potenzial für die Genregulation in Forschung und Therapie bereitstellen sowie eine neuartige Kombinationstherapie von Krebs entwickeln.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen