Sequenziergerät
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Es wurden sowohl Exome (Whole Exome Sequencing, im Folgenden WES) als auch Genome mit geringer Abdeckung (low-coverage Whole Genome Sequencing, im Folgenden lcWGS) sequenziert. Das Alinieren der ermittelten Sequenzen (im Folgenden "Reads") und die Identifikation von Varianten (im Folgenden "Variant-Calling") wurden mit der mitgelieferten Software auf dem zur Seite gestellten Rechner durchgeführt. Zwischen 34 und 49 Millionen Reads konnten pro WES-Lauf sequenziert werden. Ungefähr 80% der ermittelten Nukleotide zeigten einen PHRED-Qualitätswert von über 20 (dies entspricht einer Fehlerwahrscheinlichkeit von höchstens 1%; auf der Illumina-Platform wird in der Regel eine Qualitätsschwelle von 30, d.h., Fehlerwahrscheinlichkeit von höchstens 0,1%, angesetzt). 90% der WES- Reads waren im Zielbereich (d.h., wurden einem exonischen Abschnitt zugeordnet), die Abdeckung des Zielbereichs mit mindestens 20 Reads konnte für 87% der Basenpositionen im Zielbereich erreicht werden. Bei einem typischen WES-Lauf beobachteten wir 56.544 identifizierten Varianten mit einem Ti/Tv-Verhältnis von 1,85 wobei 52% der Varianten außerhalb des Zielbereiches lagen. Das Verhältnis der synonymen zu nichtsynonymen Varianten war 1,21 und das het/hom-Verhältnis war 1,71. Die Verteilung der Variantenkategorien entsprach in etwa unserer Erwartung (z.B. 10429 Missense-Varianten, 97 Nonsense-Varianten usw.). Darüber hinaus wurde lsWGS durchgeführt. Um das System zu testen haben wir eine Gruppe von Patienten jeweils mit einer unterschiedlichen Menge an DNA bzw. mit einer unterschiedlichen (angepeilten) Abdeckung sequenziert. Ein Ziel der Analyse war zu prüfen ob das Proton-Gerät in der Lage ist, den aktuellen Goldstandard in der Diagnostik von Kopienzahlvarianten ("CNVs") zu ergänzen oder gar ersetzen. Wir haben in einem initialen Experiment daher jede Probe jeweils mit 500ng (0.2x Abdeckung) oder 100ng (0.1x Abdeckung) sequenziert. BAM-Alignment-Dateien wurden mit der Torrent-Suite-Software erstellt und darauf hin mit CNVnator auf das Vorliegen von CNVs untersucht. Wegen der gewählt geringern Abdeckung wurden größere genomische Fenster für CNVnator verwendet (5000,25000 und 75000 bp). Wir verglichen unsere Ergebnisse mit dem Goldstandard (Array- CGH-Daten von denselben Patienten) und ermittelten eine Sensitivität von 34% (5000 bp Fenster), 29% (25000 bp Fenster) bzw. 22% (75000 bp Fenster). Die Gesamtzahl von identifizierten CNVs reicht von 54 (75000 bp Fenster) bis 314 (5000 bp Fenster), wovon die meisten durch die Array CGH Analyse nicht vorhergesagt wurden und wahrscheinlich falsch positive Ergebnisse sind. Unsere Schlussfolgerung ist es, dass eine WES mit ausreichender Abdeckung möglicht ist. Die Basenqualität (gemessen sowohl mit PHRED-Score als auch mit unserer technologie-unabhängigen Methode ist jedoch nicht völlig zufriedenstellend. Das Gerät ist eingebettet in die Sequenzierfacility des Berlin-Brandenburg Centers für Regenerative Therapies (BCRT). Über Kooperationen innerhalb des BCRT hinaus bietet die facility auch Service für die ganze Charité an, der von vielen anderen Gruppen wahrgenommen wird. Über diese Projekte sind in den letzten 2 Jahren > 20 Publikationen entstanden, an denen die Sequenzierfacility beteiligt war. Es wurde verschiedene Anwendungen durchgeführt, insbesondere jedoch Panel-Sequenzierung, WES und RNA-seq. So konnte erfolgreiche eine Mutationsanalyse bei einer Reihe von seltenen Erkrankungen durchgeführt wurden und neue Krankheitsgene entdeckt bzw. weiter untersucht werden. Hierzu gehören Synpolydactyly (HOXD13),cutis laxa (P5CS), NF1, Vici syndrome (EPG5), primäre Immundefizienz (IL21R). Zudem wurden RNA-seq Experimente durchgeführt sowie Methodenentwicklung bei T-Zell Rezeptor-Repertoire.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Loss-of-function mutations in the IL- 21 receptor gene cause a primary immunodeficiency syndrome. J Exp Med. 2013 Mar 11;210(3):433-43
Kotlarz D, Ziętara N, Uzel G, Weidemann T, Braun CJ, Diestelhorst J, Krawitz PM, Robinson PN, Hecht J, Puchałka J, Gertz EM, Schäffer AA, Lawrence MG, Kardava L, Pfeifer D, Baumann U, Pfister ED, Hanson EP, Schambach A, Jacobs R, Kreipe H, Moir S, Milner JD, Schwille P, Mundlos S, Klein C
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TCR repertoire analysis by next generation sequencing allows complex differential diagnosis of T cell-related pathology. Am J Transplant. 2013 Nov;13(11):2842-54
Dziubianau M, Hecht J, Kuchenbecker L, Sattler A, Stervbo U, Rödelsperger C, Nickel P, Neumann AU, Robinson PN, Mundlos S, Volk HD, Thiel A, Reinke P, Babel N
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First description of a patient with Vici syndrome due to a mutation affecting the penultimate exon of EPG5 and review of the literature. Am J Med Genet A. 2014 Dec;164A(12):3170-5
Ehmke N, Parvaneh N, Krawitz P, Ashrafi MR, Karimi P, Mehdizadeh M, Krüger U, Hecht J, Mundlos S, Robinson PN
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Neurofibromin inactivation impairs osteocyte development in Nf1Prx1 and Nf1Col1 mouse models. Bone. 2014 Sep;66:155-62
Kühnisch J, Seto J, Lange C, Stumpp S, Kobus K, Grohmann J, Elefteriou F, Fratzl P, Mundlos S, Kolanczyk M
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Double NF1 inactivation affects adrenocortical function in NF1Prx1 mice and a human patient. PLoS One. 2015 Mar 16;10(3):e0119030
Kobus K, Hartl D, Ott CE, Osswald M, Huebner A, von der Hagen M, Emmerich D, Kühnisch J, Morreau H, Hes FJ, Mautner VF, Harder A, Tinschert S, Mundlos S, Kolanczyk M
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Recurrent De Novo Mutations Affecting Residue Arg138 of Pyrroline-5-Carboxylate Synthase Cause a Progeroid Form of Autosomal-Dominant Cutis Laxa. Am J Hum Genet. 2015 Sep 3;97(3):483-92
Fischer-Zirnsak B, Escande-Beillard N, Ganesh J, Tan YX, Al Bughaili M, Lin AE, Sahai I, Bahena P, Reichert SL, Loh A, Wright GD, Liu J, Rahikkala E, Pivnick EK, Choudhri AF, Krüger U, Zemojtel T, van Ravenswaaij-Arts C, Mostafavi R, Stolte-Dijkstra I, Symoens S, Pajunen L, Al- Gazali L, Meierhofer D, Robinson PN, Mundlos S, Villarroel CE, Byers P, Masri A, Robertson SP, Schwarze U, Callewaert B, Reversade B, Kornak U
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A homozygous HOXD13 missense mutation causes a severe form of synpolydactyly with metacarpal to carpal transformation. Am J Med Genet A. 2016 Mar;170(3):615-21
Ibrahim DM, Tayebi N, Knaus A, Stiege AC, Sahebzamani A, Hecht J, Mundlos S, Spielmann M
