Development and risk assessment of transgenic environmentally-friendly insect pest control methods for fruit flies and mosquitoes
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Schadinsekten verursachen jedes Jahr große Schäden in der Agrarwirtschaft oder übertragen tödliche Krankheiten auf Mensch und Tier. Eine erfolgreiche Strategie zur Schädlingsbekämpfung ist die Sterile Insekten Technik (SIT). Diese beruht auf der Freisetzung von großen Mengen gezüchteter, radioaktiv bestrahlter und dadurch sterilisierter Männchen, die nach Freilassung im Feld zu unfruchtbaren Paarungen führen und dadurch eine kontrollierte Dezimierung der Populationsgröße bewirken. Einige Komponenten der SIT lassen sich jedoch nicht einfach auf weitere Schadinsekten übertragen. Genetische Methoden bieten hier vielfältige Lösungsansätze zur umweltfreundlichen und nachhaltigen Populationskontrolle von Schadinsekten, unter anderem durch Erzeugung von Sterilitätsstämmen für die Sterile Insektentechnik (SIT) oder ähnlichen Technologien. Dies erfordert jedoch neben guter Sequenzinformation auch die Etablierung verschiedenster genetischer Werkzeuge in der jeweiligen Zielspezies. Die erzeugten Stämme müssen dann auf ihre Eignung für Bekämpfungsprogramme zunächst im Labormaßstab getestet werden. Hierbei spielt die Fitness der transgenen Stämme sowie die Expressionsstärke und die genetische Stabilität der Transgenkonstrukte in den Insekten eine wichtige Rolle. Innerhalb des Emmy Noether-Programms wurden diese Ziele für mehrere bedeutende Agrarschädlinge (C. capitata, A. suspensa, A. ludens, und D. suzukii) sowie für die Gelbfiebermücke Ae. aegypti als einem der wichtigsten Vektorinsekten weltweit, erfolgreich umgesetzt. Dazu wurden zuerst Vektoren für einen rekombinationsvermittelten DNA-Kassettenaustausch (RMCE) erstellt. Die Zielvektoren enthielten heterospezifische FRT- und loxP-Rekombinationsstellen für die repetitive Geninsertion an definierten Zielstellen nach anfänglicher Integration der Vektoren in die Keimbahn von Schadinsekten. Für die spätere Integration transgener Systeme an den Zielorten wurden außerdem Donorvektoren mit der Fähigkeit zum RMCE geschaffen und verschiedene biologische Fragestellungen damit untersucht. Anschließend wurden die Targetvektoren in die Schadspezies transformiert, um zuerst die Funktionalität des jeweiligen RMCE Systems zu zeigen. Dies konnte in allen Spezies mittels Cre-lox oder phiC31-attP erreicht werden, während Versuche des Flp-FRT Systems nicht zu Integrations- oder RMCE Ereignissen führten. Zusätzlich konnte die CRISPR-Cas Technologie in D. suzukii und C. capitata etabliert werden. Die erstellten Stämme wurden dann Fitness-Tests unterzogen und molekular charakterisiert, um deren Nützlichkeit für Forschung und Anwendung zu evaluieren. In allen Spezies konnten mehr als fünf Linien erstellt und evaluiert werden. Im Falle der Ae. aegypti RMCE Linien, wurden die finalen Linien auch mit der Insect Transgenesis Facility in Maryland, US, ausgetauscht, um diese einem breiten Feld an Wissenschaftlern zugänglich zu machen. Mithilfe der RMCE und CRISPR-Cas Systeme konnten verschiedene biologische Phänomene untersucht und Neue identifiziert werden. Es konnte z.B. gezeigt werden, dass der 3xP3 Promotor, der universell in vielen Insekten und speziell Dipteren als spezifischer Augenmarker eingesetzt werden kann, in Tephritiden nicht exprimieren kann. Außerdem konnte gezeigt werden, dass ein Promoter des Spermatogenese-spezifischen beta2-Tubulin Gens, nicht auf dem Y-Chromosom funktioniert und dort ausgeschaltet wird. Des weiteren wirkt sich die Integration von mehreren Transgenen am selben Ort auf die Expressionsstärke umliegender Gene aus, was dazu führt, dass die Fitness von genetisch veränderten Insekten immer nur in den finalen Stämmen erhoben und evaluiert werden kann. Die in diesem Antrag entwickelten Systeme zur Verbesserung von Expression und Stabilisierung von Transposon-basierten Vektoren haben dazu beitragen, dass die unterschiedlichsten genetischen Systeme nun miteinander verglichen werden können und damit eine Abschätzung zur Effektivität als auch der Stabilität unterschiedlicher Elemente gemacht werden kann. Diese Parameter sind für eine Risikoabschätzung neuer genetischer Systeme von großer Bedeutung und werden gerade auch Wissenschaftlern helfen, die an eindeutigen Vergleichen von Merkmalen für die Grundlagenforschung in Schadinsekten interessiert sind.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2013) A functional comparison of the 3xP3 Promoter by recombinasemediated cassette exchange in Drosophila and a Tephritid Fly, Anastrepha suspensa. G3: Genes, Genomes, Genetics 3(4): 687–693
Schetelig MF, Handler AM
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(2014) Fitness cost implications of phiC31-mediated site-specific integrations in target-site strains of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens (Diptera: Tephritidae). PLoS One 9(10): e109690, 1–10
Meza JS, Díaz-Fleischer F, Sánchez-Velásquez LR, Zepeda-Cisneros CS, Handler AM, Schetelig MF
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(2014) Male-specific Y-linked transgene markers to enhance biologically-based control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens (Diptera: Tephritidae). BMC Genetics 15 Suppl2: S4, 1-7
Meza JS, Schetelig MF, Zepeda-Cisneros CS, Handler AM
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(2016) Tetracycline-suppressible female lethality and sterility in the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Insect Molecular Biology 25(4): 500-508
Schetelig MF, Targovska A, Meza JS, Bourtzis K, Handler AM
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(2016) The whole genome sequence of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Wiedemann), reveals insights into the biology and adaptive evolution of a highly invasive pest species. Genome Biology 17(1): 1-17
Papanicolaou A, Schetelig MF, et al.
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(2017) Cre/lox-Recombinase-Mediated Cassette Exchange for Reversible Site-Specific Genomic Targeting of the Disease Vector, Aedes aegypti. Scientific Reports 7:43883
Häcker I, Harrell II RA, Eichner G, Pilitt KL, O’Brochta DA, Handler AM, Schetelig MF
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(2017) CRISPR/Cas-mediated gene editing using purified protein in Drosophila suzukii (Matsumura). Entomologia Experimentalis et Applicata 164(3): 350-362
Kalajdzic P, Schetelig MF
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(2018) Highly efficient genome editing by homology-directed repair using Cas9 protein in Ceratitis capitata. Insect Biochemistry and Molecular Biology 101:85-93
Aumann RA, Schetelig MF, Häcker I
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(2019) Genomic targeting by recombinase-mediated cassette exchange in the spotted wing drosophila, Drosophila suzukii. Insect Molecular Biology 28(2):187-195
Schetelig MF, Yan Y, Zhao Y, Handler AM
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(2019) Overexpression of an antioxidant enzyme improves male mating performance after stress in a lek-mating fruit fly. Proceedings of the Royal Society B 286: 20190531
Teets N, Dias VS, Pierce B, Schetelig MF, Handler AM, Hahn D
