Charakterisierung der Regulation und Funktion des Epithelialen Zelladhäsionsmoleküls EpCAM in murinen embryonalen Stammzellen

• Antragsteller: Professor Dr. Olivier Gires
• Fachliche Zuordnung: Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Phoniatrie und Audiologie
• Förderung: Förderung seit 2012
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 231703341

Epithelial Cell Adhesion Molecule EpCAM ist ein Membranprotein, welches im Verlauf der Embryonalentwicklung und in Tumoren selektiv exprimiert wird. Zell-spezifische Expression von EpCAM in der physiologischen und pathologischen Differenzierung wird durch eine dynamische Regulation auf mRNA und Proteinebene erreicht. Unsere und weitere Arbeitsgruppen haben Timing und Rationale für diese selektive Expression in Tumoren und der Embryonalentwicklung untersucht. In Tumoren fördert EpCAM Proliferation und Tumorwachstum nach Intramembranproteolyse durch das Binden der intrazellulären Domäne EpICD an Promotoren der Zellzyklusregulation. In pluripotenten embryonalen Stammzellen (ESC) ist EpCAM stark exprimiert. Eine selektive Regulation von EpCAM in der Differenzierung erfolgt bei der Epithelial-Mesenchymalen Transition (EMT) in der Gastrulation, der metastatischen Kaskade und in Therapie-resistenten Tumorzellen. In der vergangenen Förderperiode zeigten wir, dass früh in der Embryonalentwicklung der Maus mesodermale Zellen EpCAM herunterregulieren und endodermale Zellen die Expression beibehalten. „Gain- und Loss-of-function“ von EpCAM stören diese Regulation und hemmen die Bildung endo- und mesodermaler Zellen, inklusive Kardiomyozyten. Zur detaillierten Analyse der EpCAM Regulation haben wir mittels CRIPR-Cas9 EpCAM-GFP Reporterlinien in ESC etabliert, welche in ihrer Pluripotenz und Differenzierung vollständig funktionsfähig sind. Zudem stehen EpCAM-Knockout ESC Linien und RNAseq-basierte Vergleiche der Transkriptome wild-typischer und EpCAM-Knockout ESCs in der Differenzierung zur Verfügung.Das Verständnis der molekularen Mechanismen zur selektiven EpCAM Regulation und zum Einfluss von EpCAM auf die Zelldifferenzierung bleibt bis dato unvollständig. Daher befassen wir uns im Rahmen des vorgeschlagenen Vorhabens mit folgenden Fragen:1. Was ist die Funktion EpCAMs in der Aufrechterhaltung der Pluripotenz in ESC?2. Wie steuert EpCAM das Austreten aus der Pluripotenz in der frühen Differenzierung?3. Welche Rolle spielt EpCAM bei der Regulation des Wnt Signalweges?4. Wie beeinflusst EpCAM die Entwicklung endo- und mesodermaler Zelltypen in späteren Phasen der embryonalen Differenzierung?Hierzu werden definierte endo- und mesodermal Zelltypen und EpCAM-GFP Reporterlinien verwendet, um die Regulation und Funktion von EpCAM in 3D Modellen der ESC Differenzierung zu beleuchten. Mittels mRNA-Sequenzierung in wildtypischen und Knockout Klonen werden wir down-stream Zielgene von EpCAM in ESC identifizieren. Unter Verwendung eines „whole genome CRISPR-knockout library” Screens werden up-stream Regulatoren der EpCAM Expression definiert, die eine Rolle bei der Zelldifferenzierung spielen. Zusammenfassend sind die Hauptziele des Vorhabens die Aufklärung der molekularen Mechanismen der selektiven EpCAM Expression und dessen Funktion in der Regulation der ESC Differenzierung.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen