Characterization of the Regulation and Function of Epithelial Cell Adhesion Molecule EpCAM in Mouse Embryonic Stem Cells
Final Report Abstract
Das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM ist vornehmlich für seine starke Expression und als therapeutisches Zielmolekül in Karzinomzellen bekannt. In Tumorzellen spielt EpCAM eine Rolle bei der Regulation des Zellzyklus und induziert einen tumorigenen Phänotyp. Die Induktion EpCAM-abhängiger Signalwege in Karzinomzellen erfolgt über eine regulierte intramembrane Proteolyse (RIP) und die Bildung einer Signal-transduzierenden, intrazellulären Domäne EpICD, die an der Regulation von Zellzyklusproteinen wie Zyklin D1 teilnimmt. Die starke Expression von EpCAM ist ebenfalls ein Merkmal pluripotenter embryonaler Stammzellen (ES Zellen). Die Rolle von EpCAM in ES Zellen ist jedoch nur unzureichend bekannt. Wir konnten eine RIP-abhängige Bildung von Subdomänen von EpCAM in ES Zellen nachweisen und die beteiligten Aminosäuren und relevanten Proteasen identifizieren. Ähnlich wie in Tumorzellen kommt es zur Bildung einer löslichen Ektodomäne, einer Aβ-ähnlichen Domäne und einer intrazellulären EpICD Domäne. Im Gegensatz zu Tumorzellen konnte jedoch keine Kerntranslokation von EpICD und keine Interaktion mit Komponenten des WNT Signalweges nachgewiesen werden. Es ist daher anzunehmen, dass die RIP von EpCAM in ES Zellen bevorzugt eine Degradation des Proteins bewirkt. Dies ist von besonderem Interesse, da wir des Weiteren einen kompletten Verlust der Expression von EpCAM bei der Differenzierung von ES Zellen aufweisen konnten. Bei der 3D-Differenzierung von ES Zellen in vitro und in der frühen Embryogenese kommt es zu einem kompletten Verlust von EpCAM in mesodermalen Zellen und zu einer Aufrechterhaltung der Expression in endodermalen Zellen, insbesondere in Epithelzellen. Vimentin-positive, mesenchymale Zellen waren stets EpCAM-negative und vice versa. Eine künstliche Aufrechterhaltung von EpCAM in ES Zellen hatte einen hemmenden Einfluss auf die Bildung von Kardiomyozyten, welche durch mesodermale Differenzierung spontan entstehen. Einhergehend mit dem Fehlen einer Kerntranslokation von EpICD, konnten wir eine hemmende Wirkung ausschließlich für das intakte EpCAM Molekül, jedoch nicht für Subdomänen wie das C-terminale Fragment oder EpICD nachweisen. Mit Hilfe eines quantitativen SILAC Ansatzes konnten wir neue Interaktionspartner von EpCAM in Teratomzellen identifizieren und in ES Zellen validieren. Ein besonderes Augenmerk haben wir auf die ES Zell-spezifische Ras Variante ERas gelegt. ERas interagiert mit EpCAM, initiiert die EpCAM-abhängige Aktivierung der AKT Kinase und hemmt ebenfalls die Bildung von Kardiomyozyten. Somit konnten wir einen neuen EpCAM-ERas-AKT Signalweg in ES Zellen identifizieren, welcher die mesodermale Differenzierung dieser Zellen hemmt. Unter Verwendung eigens generierter zellulärer Knockout Mutanten der EpCAM und ERas Gene in ES Zellen untersuchen wir derzeit den Einfluss eines Verlustes beider Proteine einzeln und in Kombination. Auf diese Weise werden wir ein umfassendes Bild ihrer Funktion bei der Differenzierung von embryonalen Stamm und Tumorzellen erhalten. Die Befunde sind sowohl für das Gebiet der Differenzierung von Stammzellen als auch für die Tumorprogression, bei der phänotypische Wechsel entlang einer epithelialen-zu-mesenchymalen Transition eine entscheidende Rolle bei der Zirkulation und Disseminierung von Tumorzellen spielen, von Bedeutung. EpCAM bildet sich somit als ein wichtiger molekularer Schalter dieser komplexen Vorgänge heraus.
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