Experimentelle Studien zur Diagnostik und Therapie von Mikrometastasen kindlicher Tumoren durch photodynamische Verfahren
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Zellkulturexperimente: Als repräsentativ fur das Hepatoblastom wurde die humane Zelllinie HuH6 gewählt, für das Neuroblastom die Zelllinie NBI 1. Fibroblasten (humane Nl) dienten als Vergleichszelllinien. Es konnten Inkubationsbedingungen mit 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) gefunden werden, die zu einer hohen Protoporphyrin IX (PpIX)-Akkumulation in den Tumorzeil Unien führten. Hierbei war bei den Fibroblasten nur eine geringe PpIX-Akkumulation festzustellen. Auf die Bestrahlung mit Licht von unterschiedlicher Dosis reagierten die 5-ALA-inkubierten HuH6- Tumorzellen am empfindlichsten, die Nl-Fibroblasten am wenigsten empfindlich. Der maßgebliche Zelltodmechanismus im Bereich gut wirksamer Bestrahlungsdosen (LD50) ist die Nekrose, die Induktion von Apoptose ist bei den untersuchten Zelllinien auf den subletalen Dosisbereich beschränkt. Tierexperimente: Nach laparoskopisch assistierter subperitonealer Implantation von Hepatoblastomzellen bei immuninkompetenten Ratten (mu / mu) wurden zunächst die Pharmakokinetik und dann die Tumorselektivität der PpIX-Akkumulation bestimmt. Das Maximum der Fluoreszenzintensität im Tumorgewebe wurde dabei im Median 150 Minuten nach intraperitonealer Injektion von 5- ALA erreicht. Bezüglich der Selektivität der PpIX-Anreicherung wurden die Verhältnisse der Fluoreszenzintensitäten zwischen Tumor und Referenzgeweben bestimmt. Dabei zeigte sich für den relevanten Zeitraum zwischen 100 und 200 min nach Photosensibilisierung im Vergleich zum benachbarten Peritoneum oder zur Leber im Mittel eine 7 bis 23-fach erhöhte Intensität, im Vergleich zum Darmgewebe eine 3-6-fach erhöhte Intensität. Auch an den, nach Versuchsende entnommenen, Gefrierschnitten war die hohe Selektivität der PpIX-Am-Anreicherung im Tumor gegenüber dem peritonealen Wirtsgewebe anhand der roten PpIX-Fluoreszenz zu sehen. Mit der aus der Pharmakokinetik als optimal ermittelten Inkubationszeit von 150 min nach Verabreichung von 5-ALA wurden in einer zweiten Serie Bestrahlungsversuche durchgeführt. Dabei zeigte sich in allen Fällen bei Bestrahlung der photosensibilisierten Tumoren eine deutliche phototoxische Nekrose, welche bei nicht-sensibilisierten aber bestrahlten Tumor-Kontrollen ausblieb. Die Tiefe der erzielbaren Nekrose betrug bis zu 10,5 mm. Durch Bestrahlung der Leber kormte ebenfalls eine phototoxische Nekrose in Tiefen bis 3,9 mm erzielt werden, die Bestrahlung des Peritoneums erbrachte keinen nachweisbaren Effekt. In Zusammenschau der in vitro und in vivo Versuche war in den Neuroblastom- und Hepatoblastom-Zelllinien eine eindeutige, selektive PpIX-Akkumulation mit einer entsprechenden Photosensibilisierung nachweisbar. Im Tierversuch zeigte sich für das Hepatoblastom ebenfalls eine tumorselektive Anreicherung von PpIX und eine phototoxische Reaktion nach Bestrahlung. Dies gewährleistet vielversprechende Aussichten sowohl für den fluoreszenzdiagnostischen (PDD) als auch den selektiven phototherapeutischen (PDT) Einsatz im Rahmen einer klinischen Anwendung. Nach unseren bisherigen Ergebnissen muss bei einer Bestrahlung im Bereich der Leber berücksichtigt werden, dass auch normales Lebergewebe phototoxisch reagieren kann. Dies ist klinisch jedoch angesichts der geringen Eindringtiefe wahrscheinlich als unbedenklich einzustufen. Die bei den Versuchstieren induzierten Nekrosen hatten keinen Einfluss auf das Überleben. Besonderheiten im Projektverlauf und bei den Ergebnissen: Bei den in vitro Versuchen traten unerwartete Anfangsschwierigkeiten bei Anzucht und Manipulation v.a. der NBI 1-Zellen auf, die erst nach Tests verschiedener Beschichtungen der Plattenböden gelöst werden konnten. Bei den in vivo Bestrahlungsversuchen ergab sich ein interessantes und überraschendes Ergebnis. Es zeigte sich eine gesteigerte Autofluoreszenz in allen Bereichen, in denen PpIX-Fluoreszenz durch die Bestrahlung ausgeblichen war. Dies ermöglichte eine Unterscheidung zwischen Spontannekrose und phototoxisch induzierter Nekrose. Fazit: Die PDT kindlicher Tumoren erscheint weiterhin aussichtsreich und lässt eine Verbesserung der klinischen Versorgung der Kinder erwarten. Unsere auf diesem Gebiet weltweit ersten und erfolgreichen Untersuchungen sprechen fÜr eine Fortsetzung des Projektes mit einigen grundlegenden Untersuchungen (z.B. Interaktionen mit Chemotherapeutika) und dem Ziel eines klinischen Einsatzes.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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"In vitro and in vivo evaluation of photodynamic techniques for the experimental treatment of human hepatoblastoma and neuroblastoma: preliminary results". Pediatr Surg Int. 2008 Dec;24(12):1331-3
Bergmann F, Stepp H, Metzger R, Rolle U, Johansson A, Till H
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Preliminary results: In vitro and in vivo evaluation of photodynamic techniques for the experimental treatment of human hepatoblastoma and neuroblastoma. Medical Laser Application 2009,24(2)134-5
Bergmann F, Stepp H, Metzger R, Rolle U, Johansson A, Heide M, Till H
