Charakterisierung von de-ubiquitylierenden Enzymen in der Regulation von Apoptose

• Antragstellerin: Dr. Meike Brömer
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 233179922

In Drosophila wird das Überleben oder Sterben von Zellen durch Apoptose hauptsächlich durch das Inhibitor of Apoptosis (IAP) Protein DIAP1 bestimmt. Die Inaktivierung von DIAP1 führt zu sofortiger Aktivierung von Caspasen und Zelltod durch Apoptose. DIAP1 reguliert die Initiator-Caspase DRONC (Homolog von Caspase-9) und die Effektor-Caspasen drICE und Dcp-1 (gemeinsame Homologe von Caspase-3 und -7). Eine RING Domäne verleiht DIAP1 Aktivität als E3-Ligase für Ubiquitin und das Ubiquitin-ähnliche Protein Nedd8. Diese Funktion ist für die Regulation von Caspasen und Apoptose unbedingt notwendig. Durch die Konjugation des 8 kDa Proteins Ubiquitin an Lysine in Zielproteinen kann eine Vielzahl von Effekten ausgelöst werden. Ubiquitin kann nicht nur als einzelnes Protein angehängt werden (Mono-Ubiquitylierung), sondern kann über Lysine in seiner eigenen Sequenz Ketten formen (Poly-Ubiquitylierung). Einen großen Einfluß auf die Konsequenz der Ubiquitylierung hat dabei der Verknüp-fungspunkt, d.h. an welches der 7 internen Lysine das nächste Ubiquitin angefügt wird. Am besten untersucht sind Lysin (K)-48-verknüpfte Ketten, die zum proteasomalen Abbau des ubiquitylierten Proteins führen. K63-Ketten hingegen fördern hauptsächlich die Bildung von Proteinkomplexen und können so Signaltransduktionsprozesse steuern. Um Ubiquitin wieder von Proteinen zu entfernen, existieren spezialisierte de-ubiquitylierende Enzyme (DUBs).Die Ubiquitylierung von Caspasen durch DIAP1 ist essenzieller Bestandteil der anti-apoptotischen Wirkung von DIAP1. DIAP1 ubiquityliert die Initiator-Caspase DRONC sowie die Effektor-Caspasen Dcp-1 und drICE. Neueste Daten weisen dabei auf einen nicht-degradativen Mechanismus hin, der Caspasen inaktiviert. Für die Aktivierung der Caspasen bedeutet dies, dass die Ubiquitylierung wieder entfernt werden muss. Um De-ubiquitylierende Enzyme zu identifizieren, die an der Regulation von Apoptose beteiligt sind, haben wir einen in vivo RNAi screen durchgeführt. Dafür wurden Drosophila RNAi Linien für alle bekannten und putativen de-ubiquitylierende Enzyme benutzt. Die RNAi wurde spezifisch während der Entwicklung im Auge zusammen mit den pro-apoptotischen IAP-Antagonisten reaper oder hid (head involution defective) exprimiert und mögliche Veränderungen des durch Apoptose verursachten small-eye Phänotyps untersucht. Auf diese Weise konnten neue Gene identifiziert werden, die an der Regu-lation von Apoptose beteiligt sind.Zwei der in diesem Screen gefundenen de-ubiquitylierenden Enzyme möchten wir in dieser Studie in Bezug auf ihre Rolle in der Regulation von Apoptose näher charakterisieren. Dies wird zur Identifizie-rung neuer Mechanismen führen, durch die das Überleben oder Sterben einer Zelle kontrolliert wird.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen