Repression mechanisms of the Notch-signalling pathway in Drosophila

• Antragsteller: Dr. Dieter Maier
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 233392621

Der Notch-Signalweg dient höheren Eumetazoen der interzellulären Kommunikation. Viele Humaner-krankungen gehen auf Defekte im Notch-Signalweg zurück, weswegen das Verständnis seiner Regu-lation von weitreichender Bedeutung ist. Die Aktivierung des namengebenden Rezeptors Notch führt zur Freisetzung der intrazellulären Notch Domäne (ICN), die im Zellkern als Koaktivator in einem Akti-vatorkomplex die Transkription der Notch Zielgene antreibt und somit die zelluläre Antwort steuert. Die Kristallstruktur des Aktivatorkomplexes ist bekannt. Im Zentrum steht der CSL-Transkriptionsfaktor, der neben ICN weitere Koaktivatoren rekrutiert. Ohne Notch-Signal baut CSL einen Repressorkomplex mit diversen Korepressoren auf, der die Notch Zielgene stilllegt. Ziel des Projektes ist es, die Struktur des Notch Repressorkomplexes im Modellsystem Drosophila zu charakterisieren. Hier besteht der Repressorkomplex aus dem CSL-Homolog Su(H), dem Protein Hairless (H) sowie weiteren, allgemeinen Korepressoren. Su(H) bindet mit seiner C-terminalen Domäne (CTD) an die nur 16 Aminosäuren umfassende NT-Domäne in H. In dieser konnten wir eine Aminosäure identifizieren, die für die Bindung an Su(H) essentiell ist. Die Affinität der H-Bindung an Su(H) entspricht der von ICN. Trotzdem kann ICN H in vitro aus dem Repressorkomplex verdrängen, ver-mutlich über eine Konformationsänderung von Su(H). In Kollaboration mit Prof. R. Kovall (University of Cincinnati) soll eine Strukturanalyse des H-Su(H) Repressorkomplexes erfolgen - erste Strukturdaten liegen bereits vor und weisen auf einen hydrophoben Kontakt der H-NT Domäne mit der CTD von Su(H) hin. Auf Basis dieser Daten sollen in vitro Mutationen in Su(H) gesetzt werden, die die H-Bindung betreffen. Erste Ergebnisse sind sehr vielversprechend. Die Bindungseigenschaften der neuen Su(H) Mutanten werden biochemisch und in vitro getestet und ihre biologische Aktivität in vivo untersucht. Im Mittelpunkt des Antrags steht das 'Gene-Engineering', das in vivo Untersuchungen der in vitro erzeugten H bzw. Su(H) Mutanten erlaubt. Dabei wird der wildtypische H bzw. Su(H) Locus im ersten Schritt jeweils durch eine attP Zielsequenz ersetzt. Diese erlaubt im zweiten Schritt die positi-onsgenaue Integration beliebiger Sequenzen - hier der jeweils mutanten Genkopie -, die dadurch direkt im Organismus im normalen Kontext untersucht werden kann. Somit lassen sich die üblichen negativen Überexpressionseffekte vermeiden. Am H Locus haben wir bereits mittels homologer Re-kombination den attP-Stamm erfolgreich etabliert und somit das proof-of-principle gezeigt. Hier kön-nen jetzt die ersten konstruierten Mutanten erzeugt und untersucht werden. Analoge Ansätze am Su(H) Locus sollen nachfolgen. Langfristig soll dadurch der Prozess der Notch-Signalrepression detailliert aufgeschlüsselt werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen