Konformationelle Dynamik des ISWI Chromatin ‚Remodeling‘ Enzyms

• Antragsteller: Professor Dr. Felix Müller-Planitz
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Biochemie ; Biophysik ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 233780154

Nukleosomen bedecken den größten Teil eukaryontischer DNA und regulieren damit fast alle Funktionen des Genoms. Hoch konservierte Nukleosom ‚Remodeling‘ Enzyme kontrollieren, wo genau die Nukleosomen sich befinden, indem sie z. B. Nukleosomen entlang der DNA verschieben. ‚Remodeling‘ Enzyme der ISWI Familie schaffen es, diese Verschiebereaktion dazu zu benützen, Nukleosomen in regelmäßigen Abständen entlang der DNA zu positionieren. ISWI nimmt eine kompakte, stark autoinhibierte Struktur ein, wenn es nicht an Nukleosomen gebunden ist. Dieser Grundzustand wird durch eine Reihe von autoinhibierenden Mechanismen stabilisiert. Sobald ISWI an das Nukleosom bindet, entfaltet sich erst das katalytische Potenzial des Enzyms. Verantwortlich dafür sind stimulierende Epitope auf dem Nukleosom. Wir schlugen in der Vergangenheit vor, dass die Transformation zum aktiven Enzym massive Konformationsumlagerungen benötigt, an denen die ATPase- und die C-terminale HAND-SANT-SLIDE (HSS)-Domäne beteiligt sind.Unser übergeordnetes Ziel ist es, die globalen Konformationsumlagerungen von ISWI direkt zu visualisieren, während es von der autoinhibierten in die katalytisch aktive Konformation übergeht. Dabei werden wir auch die einzelnen Schritte aufdecken, die ISWI durchläuft, wenn es auf das Nukleosom trifft, stimulierende nukleosomale Epitope erkennt und seine Autoinhibition überwindet.Wir kombinieren quantitative Proteinquervernetzung, Massenspektrometrie, Kryo-Elektronenmikroskopie (EM), FRET, Strukturmodellierung, thermodynamische Messungen, Substratanaloga, Mutagenese, ‚pre-steady-state‘ Techniken und kinetische Modellierung. Die Kombination dieser Methoden und Ansätze erlaubt es uns, die Choreografie zwischen den verschiedenen biochemischen und strukturellen Schritten aufzudecken.Mit der vorgeschlagenen Arbeit erhalten wir beispiellose strukturelle und mechanistische Einblicke, wie dieses paradigmatische ‚Remodeling‘ Enzym sein Substrat erkennt, und wie die verschiedenen regulatorischen Elemente –wie Zahnräder in einem Motor - Hand in Hand arbeiten, damit das Enzym seine biologische Funktion erfüllen kann. Wir werden erfahren, wie diese regulatorischen Elemente funktionieren, und können dadurch Hypothesen formulieren, warum die Natur einen derart ausgefeilten regulatorischen Mechanismus für ISWI überhaupt entwickelt hat. Unsere Studie kann als Vorlage für zukünftige Analysen komplexerer ‚Remodeling‘ Maschinen dienen. Die gewonnenen mechanistischen Einsichten und die zu etablierenden Assays könnten auch für die Entwicklung von Arzneimitteln gegen einige Krebsarten interessant sein, in denen Nukleosom ‚Remodeling‘ Enzyme eine Rolle spielen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen