Zellanalyse- und Hochgeschwindigkeitssortiersystem
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Am Forschungszentrum „Kubus“ des Dr. von Haunerschen Kinderspitals wurde 2014 eine Facility für durchflusszytometrische Arbeiten eingerichtet, ausgestattet unter anderem mit einem Zellanalyse- und Hochgeschwindigkeitssortiersystem. Im Kubus sind Forschungsgruppen der Pädiatrie und Kinderchirurgie des Klinikums der Universität München tätig. Seit 2015 ist auch die Abteilung für Klinische Pharmakologie in Forschungsflächen am gleichen Standort eingezogen. Forschungsschwerpunkte des Standorts bilden die Immunologie, Hämatologie, Onkologie und Genetik. Die Facility für Durchflusszytometrie steht allen Wissenschaftlern des Kubus offen. Darüber hinaus können Arbeitsgruppen aus anderen Einrichtungen des Klinikums, Kollaborationspartner und Netzwerke das Durchflusszytometer nutzen, wenn es die Auslastung ermöglicht. Federführend betreut wird die Facility durch die Arbeitsgruppe von Prof. Christoph Klein. Der Forschungsschwerpunkt der AG Klein besteht darin, die molekularen Krankheitsursachen von primären Immundefekten (PID) und chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen bei Kindern aufzuklären. Die Nutzung des Zellsorters ist für nahezu alle Forschungsprojekte der AG Klein essentiell. Das Zellsorting nimmt insbesondere bei der Generierung von heterologen Zellsystemen (CRISPR/Cas9-vermittelter Knockout und Knockin, lentivirale Überexpression, shRNA-vermittelter Knockdown) eine entscheidende Bedeutung ein. Diese Zellsysteme dienen dazu, Patienten-spezifische Mutationen unabhängig von limitiertem primärem Patientenmaterial studieren zu können. Darüber hinaus stellt das Zellsorting häufig eine Voraussetzung für weiterführende funktionelle Assays dar, um spezifische Zielzellpopulationen untersuchen zu können. So konnte SMARCD2, eine Untereinheit des SWI/SNF-Chromatin Remodelling Komplexes, als Schlüsselfaktor der Myelopoese und Tumorsuppressor charakterisiert werden. SMARCD2 loss-of-function Mutationen wurden mittels Whole Exome Sequencing (WES) in Patienten aus 3 Familien identifiziert, die durch Neutropenie, Spezifische Granula Defizienz und Myelodysplasie mit Blastenexzess aufgefallen waren. In Maus- und Zebrafischmodellen konnte gezeigt werden, dass SMARCD2 frühe Schritte der Differenzierung von myeloiden-erythroiden Progenitorzellen reguliert. Unter Verwendung des Zellsorters konnte das Transkriptom und das Differenzierungspotential fetaler Stammzellen von SMARCD2- knock-out Mäuse untersucht werden. Des Weiteren konnten heterologe Zelllinien mittels Sorting etabliert werden, um Protein-Protein-Interaktionsstudien und Chromatin-Assays durchzuführen. In einem weiteren Projekt konnte die MYSM1-Defizienz als Ursache für syndromatisches Knochenmarksversagen identifiziert werden. Mit Hilfe durchflusszytometrischer Messungen konnte gezeigt werden, dass MYSM1-defiziente Zellen eine erhöhte Sensitivität gegenüber genotoxischem Stress aufweisen. In Rekonstitutionsexperimenten mit lentiviraler Überexpression von wild-typ MYSM1 in primären Fibroblasten und deren positiver Selektion mittels Sorting konnte gezeigt werden, dass diese Effekte kausal auf die MYSM1-Defizienz zurückzuführen sind. In weiteren vier Patienten (zwei konsanguine Familien) konnten Mutationen in CARMIL2 als Ursache von seltenen Epstein-Barr-Virus-assoziierten Weichteiltumoren mittels WES identifiziert werden. Phänotypische und funktionelle Analysen zeigten, dass die CARMIL2-Defizienz zu Defekten im CD28 Co-Signalling mit beeinträchtigter T-Zell-Aktivierung, -Differenzierung und -Funktion führt. Mit Hilfe des Zellsorters konnte CARMIL2 in humanen Zelllinien gezielt modifiziert und die entsprechenden Zellen anschließend selektioniert werden, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. In zahlreichen Projekten der AGs am Kubus spielt das Zellsorting eine entscheidende Rolle, z.B. bei der Charakterisierung der Pathomechanismen des Asthma im Kindesalter (AG Schaub), funktionellen Untersuchungen zum Hyper-IgE-Syndrom (AG Renner), der Entwicklung von Immuntherapien zur Behandlung der pädiatrischen ALL (AG Feuchtinger) oder den Arbeiten der Abteilung für Klinische Pharmakologie zur Zelltherapie und der Therapie mit TLR-Agonisten (AG Endres/Kobold, AG Schnurr). Darüber hinaus bestehen Kooperationen mit weiteren Einrichtungen der LMU, z.B. für Forschungsprojekte auf dem Gebiet des Colon- und Pankreaskarzinoms (AG Horst, AG Jung, Pathologisches Institut) oder der zellulären Immunität in der chronischen HIV-Infektion (AG Draenert, Klinische Infektiologie).
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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“Oncogenic effects of high MAPK activity in colorectal cancer mark progenitor cells and persist irrespective of RAS mutations” Cancer Research, 2017 77:1763-1774
Blaj C, Schmidt EM, Lamprecht S, Hermeking H, Jung A, Kirchner T, Horst D
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„A human immunodeficiency syndrome caused by mutations in CARMIL2“ Nature Communications, 2017, 8:14209
Schober T, Magg T, Laschinger M, Rohlfs M, Linhares ND, Puchalka J, Weisser T, Fehlner K, Mautner J, Walz C, Hussein K, Jaeger G, Kammer B, Schmid I, Bahia M, Pena SD, Behrends U, Belohradsky BH, Klein C, Hauck F
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„Chromatin-remodeling factor SMARCD2 regulates transcriptional networks controlling differentiation of neutrophil granulocytes“ Nature Genetics, 2017, 49:742-752
Witzel M, Petersheim D, Fan Y, Bahrami E, Racek T, Rohlfs M, Puchałka J, Mertes C, Gagneur J, Ziegenhain C, Enard W, Stray- Pedersen A, Arkwright PD, Abboud MR, Pazhakh V, Lieschke GJ, Krawitz PM, Dahlhoff M, Schneider MR, Wolf E, Horny HP, Schmidt H, Schäffer AA, Klein C
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„Myb-like, SWIRM, and MPN domains 1 (MYSM1) deficiency: Genotoxic stressassociated bone marrow failure and developmental aberrations“ Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2017
Bahrami E, Witzel M, Racek T, Puchałka J, Hollizeck S, Greif-Kohistani N, Kotlarz D, Horny HP, Feederle R, Schmidt H, Sherkat R, Steinemann D, Göhring G, Schlegelbeger B, Albert MH, Al-Herz W, Klein C
