Die Funktion von I-BAR Proteinen beim Clustering von VASP und der Aktinpolymerisation

• Antragsteller: Professor Dr. Jan Faix
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 234826310

Ena/VASP Proteine fungieren als Aktinpolymerasen und vermitteln die prozessive Elongation von Aktinfilamenten in Zellfortsätzen wie Filopodien und Lamellipodien. Basierend auf biochemischen Daten und TIRF-Mikroskopie konnten wir zeigen, dass tetrameres VASP einen seiner Arme verwendet, um prozessiv dem wachsenden Filamentende zu folgen, während die G-Aktinbindestellen (GABs) auf den drei anderen Ketten zur Rekrutierung und Übergabe von Aktin-Monomeren an das Filamentende zur Verfügung stehen. Dies legt formal nahe, dass ein VASP Tetramer ausreicht, um die Elongation in Lösung oder in dichter Packung auf Oberflächen zu vermitteln. Allerdings sind sowohl Prozessivität als auch Sensitivität gegenüber Capping Protein (CP) unter diesen Bedingungen markant unterschiedlich. Durch die Änderung des Oligomerisierungsgrades oder die Erhöhung der Anzahl der GABs in VASP haben wir vor kurzem bestätigt, dass die molekularen Mechanismen der VASP-vermittelten Aktin-Assemblierung in Lösung oder auf oberflächengebundenen Clustern absolut unterschiedlich sind. Bemerkenswerterweise agieren Ena/VASP-Proteine im physiologischen Kontext ausschließlich in dynamischen Multiproteinclustern unterhalb der Plasmamembran. Da das Clustering von zentraler Bedeutung für das Verständnis der VASP-vermittelten Aktinassemblierung in Zellen ist, wollen wir nun einen bedeutenden Schritt weitergehen und den Mechanismus unter möglichst physiologischen Bedingungen nachbilden. In diesem Folgeantrag wollen wir deshalb die VASP-vermittelte Aktinpolymerisation und die Dynamik des VASP-Clusters durch SH3-Domänen-enthaltende I-BAR-Proteine aus der IRSp53-Familie in oberflächengebundenen Lipiddoppelschichten rekonstituieren und mit Mehrfarben-TIRF-Mikroskopie analysieren. IRSp53 ist zwar derzeit der Hauptkandidat, um das Clustering von VASP Cdc42-abhängig voranzutreiben, allerdings ist denkbar, dass die beiden anderen IRSp53-verwandten Proteine IRTKS und Pinkbar, oder gar bislang uncharakterisierte Proteine das VASP-Clustering in Aktinassemblierungskomplexen an der Membran-Zytoskelett Grenzfläche vermitteln. Durch Pulldowns mit geeigneten Ena/VASP-Fragmenten aus Zellextrakten und anschließende Proteomik wollen wir deshalb auch neue Faktoren identifizieren und charakterisieren. Ähnlich wie bei Ena/VASP wurde auch IRSp53 mit der Ausbildung von Filopodien in Verbindung gebracht. Es wird angenommen, dass IRSp53 zur Clusterbildung, Membrandeformation und filopodialen Aktinfilament-Assemblierung beiträgt, obwohl ein klares molekulares Verständnis seiner spezifischen Funktionen in diesem Prozess bislang nicht eindeutig belegt ist. Das abschließende zentrale Ziel ist daher der CRISPR/Cas9-vermittelte Knockout von IRSp53-verwandten I-BAR Proteinen und umfassende Analysen von B16-F1 abgeleiteten Mutantenzellen, um die spezifischen physiologischen Funktionen dieser I-BAR Proteine beim Clustering von VASP, der Aktinassemblierung, Bildung von protrusiven Zellfortsätzen und Motilität eindeutig aufzuklären.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen