Die Analyse von PERIOD-Proteinkomplexen der zirkadianen Uhr im Zytoplasma

• Antragsteller: Dr. Michael Gebert
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 235474185

Zirkadiane Uhren existieren in beinahe jeder Zelle eines Säugetiers und spielen für die tageszeitab-hängige Organisation von Stoffwechsel, Physiologie und Verhalten eine wichtige Rolle. Beeindru-ckend ist, dass mindestens zehn Prozent des Genoms einer Säugerzelle unter zirkadianer Kontrolle stehen, wobei die Gene von Zelle zu Zelle zusätzlich sehr unterschiedlich sein können. Essentielle zelluläre Prozesse wie der Zellzyklus, DNA-Reparaturmechanismen oder Zellalterung werden von molekularen Uhren koordiniert und Störungen dieser können zu Krebs, Herzkreislaufproblemen, Im-mundefekten oder Fettleibigkeit führen.Der zugrundeliegende Mechanismus ist in allen Zelltypen identisch und besteht aus einem Transkrip-tions-Translations-Rückkopplungszyklus, der sich selbst erhaltende Oszillationen mit einer Periode von etwa 24 Stunden erzeugt. In diesem Kreislauf ist der heterodimere Transkriptionsfaktor BMAL1-CLOCK der Aktivator des zirkadianen Transkriptoms, das auch die Gene für die Inhibitoren zirkadianer Genexpression, die PER- und CRY-Proteine, beinhaltet. Diese verbleiben nach ihrer Synthese einige Stunden im Zytoplasma, transferieren dann in den Kern und inhibieren BMAL1-CLOCK. Nach dem Abbau der PER- und CRY-Proteine im Kern beginnt der Zyklus von Neuem.Die zytoplasmatische Retention von PER- und CRY-Proteinen ist dabei ein essentielles Charakteristi-kum der zirkadianen Uhr und verursacht eine zeitlich verzögerte Inhibierung zirkadianer Gene. Dadurch wird die Periodenlänge maßgeblich beeinflusst und eine Oszillation von Proteinen erst ermöglicht. Wie diese Retention auf Proteinebene bewerkstelligt wird, ist nicht klar und offensichtlich sind Proteine beteiligt, die bisher nicht mit der Uhr in Verbindung gebracht wurden.Ziel des von mir vorgeschlagenen Projektes ist es daher, diese unbekannten Faktoren zu identifizieren und charakterisieren. Durch Immunoaffinitätsaufreinigung werde ich zunächst zytoplasmatische PER-Proteinkomplexe aus Mauslebergewebe isolieren. Dazu kann ich im Labor auf bereits vorhandene Mausstämme zurückgreifen, in welchen das endogene PER-Protein durch ein Fusionsprotein mit FLAG-Hämagglutinin ersetzt wurde. Die Eluate der Aufreinigungen werde ich durch SDS-PAGE und Silberfärbung mit der entsprechenden Wildtypkontrolle vergleichen und spezifische Banden in den Spuren der Fusionsproteinisolationen massenspektrometrisch analysieren. Der Einfluss aufgereinigter Proteine auf Periodenlänge und Oszillationsverhalten der Uhr wird durch Depletionsexperimente in Luciferase-transgenen zirkadianen Reporterzellinien bzw. das Messen von in vivo Biolumineszenz-Rhythmen untersucht werden. Die weitere Charakterisierung neuer PER-Interaktoren werde ich auf das entsprechende Protein abstimmen.Alles in allem befasst sich mein vorgeschlagenes Projekt mit einem zentralen Baustein der biologi-schen Uhr von Säugetieren und ermöglicht daher wichtige Erkenntnisse für ein besseres Verständnis des molekularen Mechanismus zirkadianer Rhythmen.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Professor Dr. Charles J. Weitz