Automatisierter Mikrotiterplatten-Inkubator und -Reader
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Rekombinante Proteinproduktion mit Bacillus megaterium: Bacillus megaterium ist ein Gram positives Bakterium, dass seit vielen Jahren in unserer Arbeitsgruppe für die Produktion von rekombinanten Proteinen eingesetzt wird. Dazu werden in unserer Arbeitsgruppe Plasmidsysteme entwickeln, die sowohl für die intra- als auch für die extrazelluläre Produktion genutzt werden können. Zur Analyse und Quantifizierung der rekombinanten Produktion werden unterschiedliche unterschiedliche Fluoreszenzproteine (GFP, mCherry) eingesetzt. Mit dem hier beschafften Mikrotiterplatten-Inkubator und –Reader wurden zur Erstellung neuer Plasmide alternative konstitutive und induzierbare Promotoren für die rekombinante Produktion der Fluoreszenzproteine GFP und mCherry (parallelisierte online-Quantifizierung im Gerät in Mehrfachbestimmung) in B. megaterium mit dem etablierten Xylose-induzierbaren Promotorsystem vergleichen. Die rekombinante Produktion von GFP wurde außerdem genutzt, um den Einfluss von Selektionsmarkern (Antibiotikaresistenz) und Replikationsursprung auf die rekombinante Produktion und Plasmidstabilität zu untersuchen Außerdem wurden Untersuchungen des Einflusses der Codon-Usage GFP und mCherry codierender Gene auf die rekombinante Produktion untersucht. Sekretion von Antikörperfragmenten mit Stämmen der Gattung Bacillus: Für die Analyse der Produktion und Sekretion von Antikörperfragmenten in B. megaterium, B. subtilis und B. licheniformis wurden skalenübergreifende Analysen durchgeführt. Dafür wurde das hier beschaffte Gerät als Mikroinkubationsgerät genutzt, um Wachstum und Sauerstoffversorgung online zu analysieren. Untersuchungen zur genetische Kompetenz von Bacillus megaterium: Derzeit wird für die Transformation von B. megaterium eine zeitaufwändige Protoplastenpräparation genutzt. Hierbei ist die Transformationseffizient äußerst gering. Über bioinformatische Analysen konnte gezeigt werden, dass dieser Organismus alle notwendigen Gene für die Ausbildung genetischer Kompetenz besitzt. Um nun die Transformierbarkeit, insbesondere die Effizienz, zu verbessern, wurden Promotoren von identifizierten Kompetenzgenen mit gfp fusioniert und der Zeitpunkt und die Intensität der GFP Produktion mit dem hier beschafften Mikrotiterplatten-Inkubator und – Reader analysiert. Phänotypische Heterogenität während der rekombinanten Proteinproduktion in Bacillus megaterium: Die phänotypische Heterogenität wurde bereits 2006 während der rekombinanten GFP-Produktion in B. megaterium nach einer Bioreaktor-Kultivierung beobachtet. Das GFP diente hierbei als Modellprotein in der Durchflusszytometrie. Da diese keine Informationen über Mengen an rekombinant produziertem GFP geben kann, wurden alle rekombinanten Plasmid-Stämme (variierende Promotoren, Antibiotikaresistenzen, Replikationsursprünge) im beschafften Mikrotiterplatten-Inkubator und -Reader hinsichtlich Wachstum und GFP-Produktion analysiert. Zusätzlich wurde auch der Einfluss verschiedener B. megaterium–Mutanten auf die rekombinante Gfp- Produktion analysiert. Anpassung von Dinoroseobacter shibae an Eisenmangelbedingungen: Im Rahmen des TRR 51 Roseobacter wurde die Anpassung von D. shibae an wechselnde Sauerstoffverfügbarkeit und an Eisenmangel untersucht. Hierzu wurde das Wachstumsverhalten des D. shibae Wildtypstamms in Abhängigkeit von unterschiedlichen Eisenquellen (Fe(II)Sulfat, Fe(III)Citrat, Häm), also auch unter unterschiedlichen Eisenkonzentrationen untersucht. Darüber hinaus wurde das Mikroinkubationsgerät genutzt um das Wachstumsverhalten von D. shibae Transposonmutanten zu charakterisieren. So konnten Gene identifiziert werden, die für die Eisenaufnahme wichtig sind. Regulation der anaeroben Genexpression bei Bacillus subtilis: Zur Untersuchung der anaeroben Genexpression wurde der Promoter des anaerob induzierten Nitratreduktasegens (narG) mit dem Gen des grün fluoreszierenden Protein (GFP) als Reportergen bzw. dem Gen für das FMN-bindenden Fluoreszenzproteinen (FbFP) als Reportergen fusioniert. Durch die direkten Messungen der Fluoreszenz während dem Wachstum der Zellen im Mikroinkubationsgerät kann der zeitliche Verlauf der Genexpression präzise verfolgt werden. Zusätzlich ermöglicht das Inkubationsgerät auch die Messung des verfügbaren Sauerstoffs in der Kultur.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2014). Towards a cell factory for vitamin B12 production in Bacillus megaterium: Bypassing of the cobalamin riboswitch control elements. N Biotechnol. 31:553-561
Moore, S.J., Mayer, M.J., Biedendieck, R., Deery, E. & Warren, M.
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(2015). Polar fixation of plasmids during recombinant protein production in Bacillus megaterium results in population heterogeneity. Appl Environ Microbiol. 81:5976-5986
Münch, K., Müller, J., Wienecke, S., Bergmann, S., Heyber, S., Biedendieck, R., Münch, R. & Jahn, D.
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(2017) Recombinant production of the antibody fragment D1.3 scFv with different Bacillus strains. Microb Cell Fact. 16: 14
Lakowitz, A., Krull, R. & Biedendieck, R.
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(2017). FnrL and three Dnr regulators are used for the metabolic adaptation to low oxygen tension in Dinoroseobacter shibae. Front. Microbiol. 8:642
Ebert, M., S. Laass, A. Thürmer, L. Roselius, D. Eckweiler, R. Daniel, E. Härtig & D. Jahn
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(2017). Heme and nitric oxide binding by the transcriptional regulator DnrF from the marine bacterium Dinoroseobacter shibae increases napD promoter affinity. - J Biol Chem. 2017 Sep 15;292(37):15468-15480
Ebert, M., Schweyen, P., Bröring, M., Härtig, E. & Jahn, D.
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(2017). In situ affinity purification of His-tagged protein A from Bacillus megaterium cultivation using recyclable superparamagnetic iron oxide nanoparticles. J Biotechnol. 242: 55–63
Gädke, J., Kleinfeldt, L., Schubert, C., Rohde, M., Biedendieck, R., Garnweitner, G. & Krull, R.
