Dreidimensional superhochauflösendes Fluoreszenzmikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das hochauflösende Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie-System wurde hauptsächlich im hochauflösenden Modus (basierend auf dem Prinzip der strukturierten Beleuchtung) benutzt, was als 3D-SIM Mikroskopie abgekürzt wird. In diesem Modus wird eine Probe über das gesamte Gesichtsfeld hinweg mithilfe eines Laser-Interferenzmusters beleuchtet. Die Periodizität des Interferenzmusters liegt dabei am Rand dessen, was ein optisches Mikroskop auflösen kann (ca. 250 nm). Durch Überlagerung des Beleuchtungsmusters mit der Probenstruktur entstehen Mischfrequenzen, die Probenstrukturen bis ca. 100 nm Größe durch Differenzfrequenzbildung durch die Mikroskopoptik transferrieren. Die dabei aufgenommenen Bilddaten werden dann durch einen Rekonstruktionsalgorithmus im Fourierraum entmischt und den ursprünglichen räumlichen Frequenzen zugeordnet. Durch Rücktransformation in den Ortsraum erhält man auf diese Weise Fluoreszenzmikroskopie-Bilder mit der doppelten räumlichen Auflösung dessen, was ohne strukturierte Beleuchtung möglich ist. Diese Methode ist mit eine der schnellsten hochauflösenden optischen Mikroskopie-Methoden. In den vergangenen drei Jahren haben wir dieses System für eine Reihe von Forschungsergebnissen und im Rahmen von wissenschaftlichen Arbeiten mit Kollegen an der Universität Bielefeld, sowie den Universitäten Bonn, Münster, und der medizinischen Hochschule Hannover, wie auch mit Arbeitsgruppen in Norwegen (Universität von Tromsö), den USA (Universität von Kalifornien, Davis, und Mount Sinai School of Medicine, New York) und Italien (Universität von Mailand, Bicocca) eingesetzt. Die wesentlichsten Ergebnisse sind hier kurz zusammengefasst: Wir konnten zeigen, dass sich das Prinzip der strukturierten Beleuchtung nicht nur für die Aufnahme von Fluoreszenzmikroskopie-Daten anwenden lässt. Auch für Kontraste basierend auf der spontanen Raman- Streuung ist diese Methode hervorragend geeignet. Dazu wurden Gold-Nanopartikel mit einem Durchmesser von ca. 50 nm, auf deren Oberfläche das Molekül Mercaptobenzoe-Säure absorbiert ist, in Osteosarkoma-Zellen eingebracht. Durch Anregung im tiefen roten Spektralbereich (647 nm) konnte das Oberflächen-verstärkte Ramansignal dieser Goldpartikel gegen den Kontrast der Zelle, die mit einen grünen Zellmembranfarbstoff markiert war, detektiert und abgebildet werden. Der Vorteil der Raman-Streuung gegenüber Fluoreszenzfarbstoffen ist, dass dieser Kontrastmodus nicht durch kontinuierliche Einstrahlung des Anregungslichts ausgeblichen wird, also über lange Zeiträume zur Verfügung steht. Auch diese konnten wir anhand dieser Partikel mit ca. 120 nm optischer Auflösung demonstrieren. Durch schnelles Umschalten der Beleuchtungsmodi zwischen strukturierter Beleuchtung und Totalreflexion konnten wir erstmals die Struktur von Leberendothelzellen korrelativ mit 3D-SIM, wie auch mithilfe der Lokalisationsmikroskopie abbilden. Dadurch gelang es uns, Nanoporen in diesen Zellen mit einer optischen Auflösung von ca. 20 nm abzubilden und zur zeigenm, dass diese durch Aktin-Fasern des Zytoskeletts der Zelle aufgespannt werden. Weiterhin gelang es uns durch sorgfältige Wahl des Fluoreszenzfarbstoffs erstmalig, die Dynamik dieser aus physiologischer Sicht extrem wichtigen Nanoporen in lebenden Leberendothelzellen zu verfolgen. Wir konnten erstmals das Öffnen neuer Poren, das Verschmelzen von Poren, sowie das Schliessen von Poren auf der Skala von 100 nm verfolgen. Durch die Untersuchung von mit dem HI-Virus infizierten (und zu ausgewählten Zeitpunkten fixierten) menschlichen T-Zellen konnten wir in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Benjamin Chen an der Mounti Sinai School of Medicine in New York City auch zeigen, dass diese dreidimensional abbildende Fluoreszenzmikroskopie-Methode geeignet ist, einzelne HI-Viren in infizierten Zellen aufzulösen. Es gelang uns dabei, die virologische Synapse zwischen infizierten T-Zellen und neu-infizierten T-Zellen aufzulösen und Viren in Vesikeln während des Übergangs zwischen den Zellen zu detektieren. Diese Arbeiten, wie auch die grundlegenden Arbeiten zur Struktur von Leberendothelzellen sind noch in einem früheren Stadium und werden in unserem neuen Sicherheitslabor in naher Zukunft auch mit lebenden T- Zellen durchgeführt werden. Durch vergleichende optische und Ionen-Strahlmikroskopie (Helium-Ionen-Mikroskopie und 3D-SIM, sowie Lokalisations-mikroskopie) an differenzierten Stammzellen aus der Nasenscheidewand konnten wir zusammen mit den Arbeitsgruppen Kaltschmidt und Gölzhäuser in Bielefeld erstmals Lipid-Nanodomänen in diesen Zellen auflösen und darstellen. Durch Entwicklung einer von grundauf neu-geschriebenen Rekonstruktionssoftware konnten wir erstmals eine allgemeine und für die Allgemeinheit frei zugängliche universelle Softwarelösung zur Rekonstruktion von SIM-Mikroskopiedaten schaffen, die sich durch Einbindung in das frei zugängliche Bildverarbeitungsprogramm "ImageJ" auf sämtlichen PC Computersystemen einfach und schnell anwenden lässt. Zuvor gab es nur proprietäre und auf herstellerspezifische Systeme zugeschnittene Rekonstruktionssoftware.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Helium Ion Microscopy visualizes Lipid Nanodomains in Mammalian Cells, Small 11(43), 5781-5789 (2015)
M. Schürmann, N. Frese, A. Beyer, P. Heimann, D. Widera, V. Mönkemöller, T. Huser, B. Kaltschmidt, C. Kaltschmidt, A. Gölzhäuser
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Multimodal superresolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations, Scientific Reports 5, 16279 (2015)
V. Mönkemöller, C. Øie, W. Hübner, T. Huser, and P. McCourt
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Nanoparticles as Nonfluorescent Analogues of Fluorophores for Optical Nanoscopy, ACS Nano 9(6), 6196-6205 (2015)
S. Hennig, V. Mönkemöller, C. Böger, M. Müller, and T. Huser
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Open source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ, Nature Communications 7, 10980 (2016)
M. Müller, V. Mönkemöller, S. Hennig, W. Hübner, and T. Huser
