Die Funktion der Lipase-spezifischen Foldase bei der Faltung und Sekretion einer Lipase aus Pseudomonas aeruginosa

• Antragsteller: Professor Dr. Holger Gohlke; Professor Dr. Karl Erich Jaeger; Professor Dr. Claus Seidel
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 237402318

Das Gram-negative Bakterium Pseudomonas aeruginosa bildet mehrere Lipasen, darunter die Lipase LipA, die über den Typ II Sekretionsweg in den Kulturüberstand sekretiert wird. Wir konnten zeigen, dass ein sterisches Chaperon, das sog. Lif Protein (Lipase-spezifische Foldase) benötigt wird, um diese Lipase in die enzymatisch aktive Konformation zu überführen. Der dieser Aktivierung sowie der nachfolgenden Sekretion zugrundeliegende molekulare Mechanismus ist unbekannt. Wir haben Methoden entwickelt, um sowohl die Lipase LipA wie die Foldase Lif zu exprimieren und zu reinigen, sowohl im heterologen Wirst Escherichia coli wie im homologen Wirt P. aeruginosa. Weiterhin haben wir eine Rückfaltungsmethode für enzymatisch inaktive Lipase entwickelt, die es erlaubt, die Funktionalität der Foldase in vitro zu testen. In diesem Forschungsvorhaben wollen wir zwei hauptsächliche Themenbereiche bearbeiten: (1) Der Mechanismus, mit dem die Foldase enzymatisch inaktive in aktive Lipase überführt, soll aufgeklärt werden. Konformationen von Lipase und Foldase sowie deren Änderungen während des Faltungsvorgangs werden mit einer Kombination aus Computer-basierten, biophysikalischen, biochemischen und biologischen Methoden untersucht. Im Einzelnen werden die die Interaktionen zwischen Lipase und Foldase analysiert mit Methoden der Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie, basierend auf gefilterten Korrelationstechniken und hochauflösenden Messungen des Förster-Resonanzenergietransfers (FRET) sowie durch Computer-basierte Molekulardynamik-Simulationen, Berechnungen freier Energien und Stabilitätsanalysen. Der Einfluss der Membranassoziation der Foldase auf deren Dynamik und Funktion soll in artifiziellen Membransystemen untersucht werden. Erstmalig soll das Lipase-Foldase System an drei Positionen gleichzeitig markiert und mit hochauflösender FRET-Technik untersucht werden. (2) Mögliche Interaktionen der Proteine des SecEYG Komplexes mit der Foldase sollen untersucht und ihre Rolle bei der Freisetzung fertig gefalteter Lipase aus dem Lipase-Foldase Komplex analysiert werden. Die sehr ambitionierten Ziele dieses Forschungsvorhabens können nur erreicht werden, wenn die drei antragstellenden Gruppen eng zusammenarbeiten. Die Gruppe Jaeger führt molekularbiologische und biochemische Experimente durch, die Gruppe Seidel wendet verschiedene Methoden der Fluoreszenzspektroskopie an, und die Gruppe Gohlke analysiert die erhaltenen Daten mit Hilfe Computer-basierter Modellierung und Simulation. In einem iterativen Prozess werden so Daten aus biochemischen und spektroskopischen Experimenten analysiert und daraus Vorhersagen abgeleitet, die in die Planung neuer Experimente einfließen, um so den komplexen Mechanismus und die Dynamik der Foldase-vermittelten Aktivierung der Lipase zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen