Kinase fokussierte Chemoproteomik unter Verwendung gezielter Affinitätsaufreinigung und modernster, quantitativer Massenspektrometrie

• Antragsteller: Dr. Martin Golkowski
• Fachliche Zuordnung: Public Health, Gesundheitsbezogene Versorgungsforschung, Sozial- und Arbeitsmedizin ; Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2015
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 237548465

Protein Phosphorylierung durch Kinasen dient als wichtiger molekularer Schalter in den meisten zellulären Prozessen. Kinasen aktivieren und unterbrechen Signalkaskaden, vermitteln Protein-Protein Interaktionen und ihre Deregulierung führt üblicherweise zu Erkrankungen wie Krebs. Da Sie zelluläre Stimuli integrieren und beeinflussen werden die Häufigkeit und Aktivität von Kinasen oft herangezogen um Aussagen über den Status der Zelle zu ermöglichen. Kinase Inhibitoren wurden in der Vergangenheit als Affinitätsreagenzien verwendet um mittels quantitativer Massenspektrometrie die Selektivität dieser Inhibitoren für ihre Zielstrukturen zu untersuchen. Obwohl bewiesen wurde dass dies zur Anreicherung von Kinasen für deren globale Analyse geeignet ist, haben sich die betreffenden Studien nicht mit der funktionalen Charakterisierung spezifischer Signalkaskaden oder dem Aktivierungszustand der Kinasen beschäftigt. Wir schlagen deshalb eine Strategie zur gezielten Affinitätsaufreinigung von Kinasen und deren detaillierten funktionalen Charakterisierung mittels quantitativer Massenspektrometrie vor. Zu diesem Zweck sollen Affinitätsreagenzien, abgeleitet von Typ I und Typ II kinase Inhibitoren hergestellt und auf festen Trägern immobilisiert werden. Die hierdurch erzeugten Affinitätsmatrizen sollen die globale, signalwegspezifische und aktivitätsabhängige Aufreinigung von Kinasen und assoziierten Proteinen aus einem komplexen Proteom ermöglichen. Zuerst soll dies in einer Vorstudie über die Signalweg spezifische und aktivitätsabhängige Anreicherung von Proteinen erprobt werden welche Teil der epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor - mitogenaktivierten Proteinkinase Signalkaskade sind. Hierbei sollen sieben verschiedene NCI60 Zelllinien, welche allesamt wichtige humane Krebserkrankungen wiederspiegeln, als Modellproteome dienen. Die angereicherten Unterproteome sollen mittels quantitativer MS Analytik daraufhin untersucht werden (i) wievielfach die Komponenten des EGFR - MAPK Signalweges angereichert werden können, (ii) wie hoch die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Charakterisierung und Quantifizierung dieser Komponenten ist und ob (iii) die Charakterisierung der Kinasen und assoziierter Proteine, einschließlich ihrer posttranslationalen Modifikationen (PTMs), ermöglicht werden kann. Dies dient dem Zweck Informationen über den funktionale Status des EGFR - MAPK Signalweges zu erhalten. Auf einer späteren Stufe wollen wir diese Technik auf das übergeordnete ErbB Signalnetzwerk und auf aus humanem Material erhaltene Proteome ausweiten. Unser Langzeitziel ist es neuartige analytische Werkzeuge für die Krebsproteomik zur Verfügung zu stellen, welche die schnelle und detaillierte Charakterisierung entarteter Kinase Signaltransduktion erlauben. Die auf der Proteomebene erhalten Information sollen die durch Genomsequenzierung von Tumorzellen erhaltenen Erkenntnisse ergänzen und so das analytische Rüstzeug für die Bekämpfung von Krebserkrankungen erweitern.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Dr. Shao-En Ong