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Projekt
Dynamics of Peroxisomal Protein Transport
Antragsteller
Professor Dr. Christian Eggeling; Dr. Harald Platta
Fachliche Zuordnung
Biochemie
Förderung
Förderung von 2013 bis 2021
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 219314758
Das Ziel von Project 4 ist, mit Hilfe von optimierten Mikroskopie- und biochemischen Methoden neue Erkenntnisse über die Abläufe während des Imports von Matrix-Proteinen in Peroxisomen zu erhalten. Zum einen werden optische Mikroskopie-Methoden verwendet, um 1) die relative Verteilung von Proteinen wie PEX5 oder PEX14 an der peroxisomalen Membran, 2) die Diffusions- und Interaktionseigenschaften des PTS1-Rezeptors PEX5 im Zytosol und an den Peroxisomen und 3) molekulare Details der dynamischen Anbindung von Peroxisomen an das zelluläre Zytoskelett aufzuklären. Dies soll sowohl in fixierten als auch lebenden Zellen durchgeführt werden, mit dem Ziel nanoskalige räumliche Auflösung zu erreichen und die aufgeführten Protein-Eigenschaften in Abhängigkeit von den Importeigenschaften des jeweiligen Peroxisoms und nach Modifikation der Eigenschaften bestimmter peroxisomaler Proteine zu untersuchen. Dazu werden die in der ersten Finanzierungsperiode entwickelten super-auflösenden optischen Mikroskopiemethoden, wie die STED oder STED-FCS Technologie für die direkte Beobachtung des peroxisomalen Protein-Imports in Zellen verfeinernt und durch komplementäre Beobachtungsmethoden erweitert. Es sollen speziell die drei-dimensionale Beobachtung von molekularen Anordnungen und Dynamiken, Methoden zur Fluoreszenz-Markierung der involvierten Proteine als auch die Analyse der Mikroskopiedaten optimiert werden. Im zweiten Projektteil wird unter Verwendung von biochemischen Methoden das dynamische Zusammenspiel der einzelnen Komponenten der Importmaschine analysiert. Ein Fokus liegt hierbei auf dem PTS2-Importweg. 1) Es wird die Ubiquitinylierung des PTS2-Co-Rezeptors Pex21p nachgewiesen und die verantwortlichen Enzym-Kaskaden identifiziert und funktionell charakterisiert. 2) Die einzelnen Schritte des PTS2-Kargo transportierenden PTS2-Rezeptor Moduls, welches aus Pex7p sowie den Co-Rezeptoren Pex18p und Pex21p besteht, soll mittels eines definierten Import/Export Systems charakterisiert werden. 3) Es wird die dynamische Assemblierung und Desassemblierung der Importmaschine in Abhängigkeit von dem Ubiquitin-konjugierenden Enzym Pex4p untersucht. Die Art der Anbindung des Pex4p/Pex22p-Komplexes an die Importmaschine ist bisher unbekannt und scheint anders reguliert zu sein als bei den bekannten peroxisomalen Sub-Komplexen, wie dem Docking-, RING- oder AAA-Komplex. Des Weiteren zeigen erste Daten, dass Pex4p selber die dynamische Anbindung des AAA-Komplexes an die Pore reguliert. Hier soll der Mechanismus aufgeklärt werden, und es werden systematisch Isolierungen von peroxisomalen Membrankomplexen in verschiedenen genetischen Hintergründen durchgeführt.Im dritten Projektteil soll durch einen komplementären Ansatz aus mikroskopischen und biochemischen Methoden der Rezeptorzyklus des PTS2-Import Moduls sowie die dynamische Ubiquitin-abhängige Assemblierung der peroxisomalen Importmaschinerie an der Membran untersucht werden.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
Internationaler Bezug
Großbritannien
