Hybrid Quadrupol Massenspektrometer mit vorgeschaltetem UHPLC-System
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Mittels des Massenspektrometers konnten im Bereich der Proteomik in mehreren Bereichen innovative Forschungsideen erfolgreich umgesetzt werden. Der erste Bereich beschäftigt sich mit der sog. „Degradomik“, d.h. der Benutzung proteomisch-massenspektrometrischer Methoden zur Untersuchung proteolytischer Prozesse sowie zur Bestimmung von Substraten und Spezifitäten proteolytischer Enzyme.Hierbei ist insbesondere der Prozess der limitierten Proteolyse erwähnenswert, welche Schnittprodukte mit neuen Funktionen generieren kann; als Beispiele seien Zymogenaktivierung und Wachstumsfaktorreifung genannt. Aus proteomisch-analytischer Sicht werden in der Degradomik neo- Termini von Proteinen und Peptiden untersucht, die semi-tryptische Peptide darstellen. Für eine effiziente Peptid-Spektrum-Zuordnung ist bei semi-spezifischen Peptiden eine hohe Massengenauigkeit sowohl der Vorläufer (MS1) als auch der Fragmentionen (MS2) äußerst hilfreich. Diese Fähigkeit wird mit dem Massenspektrometer dargestellt. In einem ersten Projekt wurde die Anwendung proteom-basierter Peptidbibliotheken als Substratpools zur Spezifitätsbestimmung von Proteasen erweitert und in ihrer Effizienz gesteigert. Die sehr hohe Scangeschwindigkeit des Massenspektrometers erlaubt die direkte Analyse der inkubierten Substratpools ohne Anreicherungsschritte. Diese direkte Analyse ermöglichte beispielsweise die Analyse von ADAMTS- Protease der Zelloberfläche sowie ein Verständnis der Struktur-Spezifitätsbeziehung der chlamydialen CPAF Protease. In einem weiteren Projekt wurde eine neuartige Methode der sog. N-terminomik entwickelt, welche dem Auffinden nativer Proteasensubstrate in komplexen Proteomen dient. Die hohe Sensitivität des Massenspektrometers ermöglichte die N-terminomische Analyse auch kleinerer Probenmengen und schafft so die Grundlage für kombinierte Verfahren, die beispielswiese auch die molekulare Größe des proteolytischen Schnittproduktes bestimmen. Eine Anwendung der klassischen N-terminomik, zusammen mit quantitativer Proteomik, beschäftigte sich mit der Zelloberflächenprotease FAPα, welche insbesondere von tumor-assoziierten Fibroblasten hergestellt wird. Die proteomische Studie zeigte, dass FAPα eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der Tumormikroumgebung spielt. In einer parallelen Studie wurde u.a. mittels Ko- Immunopräzipitation und anschließender Proteomik gezeigt, dass FAPα auf der Zelloberfläche in sog. Lipid-Rafts lokalisiert. Beide Studien wurden durch die hohe Sensitivität des Massenspektrometers gestützt. Translationale Proteomstudien gewinnen zusehends an Bedeutung. Hierbei wird untersucht, wie sich Krankheitsprozesse in veränderten Proteomprofilen wiederspiegeln. In einem gemeinsamen Projekt mit dem Universitäts Herzzentrum Freiburg – Bad Krozingen haben wir untersucht, wie sich die mechanische Entlastung („Kunstherz“) auf das Proteomprofil des Myokards auswirkt. Wir konnten zeigen, dass verschiedene, funktionell gruppierte Proteincluster beeinflusst werden. Hier sind besonders die matrizellulären Proteine zu nennen. Die deutlich wahrnehmbare Heterogenität der „Proteomantworten“ innerhalb der Kohorte wurde durch einen gepaarten Ansatz der Analyse („patient-matched comparison) ausgeglichen. Zusätzlich zeigte sich, dass die mechanische Herzunterstützung sich auch auf intrinsische proteolytische Prozesse auswirkt. Die myokardiale Proteomstudie fand an kyrokonserviertem Gewebe statt. Jedoch ist Formalin-Fixation, Paraffin-Einbettung (FFPE) die vorherrschende Art der pathologischen Gewebearchivierung. Die Proteomanalyse von FFPE Gewebe ermöglicht retrospektive system-biologische Studien mit translationalem Bezug beispielsweise auf Therapieansprechen. Fehlregulierte Proteolyse ist ein Charakteristikum vieler Krankheiten. Um translationale Degradomikstudien zu ermöglichen haben wir gezeigt, dass FFPE Proben, zusammen mit angepassten Protokollen der Probenbereitung, eine robuste Quelle für die proteomisch-massenspektrometrische Bestimmung proteolytisch generierter Protein N-termini sind. Hierbei ist die FFPE Archivierung der Kryokonservierung mindestens ebenbürtig. Diese Arbeit legt die Grundlage für zahlreiche Folgestudien, die jetzt proteolytische Prozesse in Krankheiten auf proteom-weiter Ebene in diversen Kohorten untersuchen können. Aus technischer Sicht sind hier die spezielle Eignung des Massenspektrometers für semi-spezifische Peptide (hochgenaues MS1 und MS2) sowie die sehr gute Proteomabdeckung dank schneller Scanrate erwähnenswert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Enrichment of protein N-termini by charge reversal of internal peptides. Proteomics. 2015 Jul;15(14):2470-8
Lai ZW, Gomez-Auli A, Keller EJ, Mayer B, Biniossek ML, Schilling O
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The stromal cell-surface protease fibroblast activation proteinα localizes to lipid rafts and is recruited to invadopodia. Biochim Biophys Acta. 2015 Oct;1853(10 Pt A):2515-25
Knopf JD, Tholen S, Koczorowska MM, De Wever O, Biniossek ML, Schilling O
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Characterization of various cell lines from different ampullary cancer subtypes and cancer associated fibroblastmediated responses. BMC Cancer. 2016 Mar 8;16:195
Lai ZW, Bolm L, Fuellgraf H, Biniossek ML, Makowiec F, Hopt UT, Werner M, Keck T, Bausch D, Sorio C, Scarpa A, Schilling O, Bronsert P, Wellner UF
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Fibroblast activation protein-α, a stromal cell surface protease, shapes key features of cancer associated fibroblasts through proteome and degradome alterations. Mol Oncol. 2016 Jan;10(1):40-58
Koczorowska MM, Tholen S, Bucher F, Lutz L, Kizhakkedathu JN, De Wever O, Wellner UF, Biniossek ML, Stahl A, Lassmann S, Schilling O
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Formalin-fixed, paraffinembedded tissues (FFPE) as a robust source for the profiling of native and protease-generated protein amino termini. Mol Cell Proteomics. 2016 Jun;15(6):2203-13
Lai ZW, Weisser J, Nilse L, Costa F, Keller E, Tholen M, Kizhakkedathu JN, Biniossek M, Bronsert P, Schilling O
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Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 2016 Jul;15(7):2515-24
Biniossek ML, Niemer M, Maksimchuk K, Mayer B, Fuchs J, Huesgen PF, McCafferty DG, Turk B, Fritz G, Mayer J, Haecker G, Mach L, Schilling O
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Impact of cathepsin B on the interstitial fluid proteome of murine breast cancers. Biochimie. 2016 Mar;122:88-98
Gomez-Auli A, Hillebrand LE, Biniossek ML, Peters C, Reinheckel T, Schilling O
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Proteomic profiling of cardiomyocyte-specific cathepsin A overexpression links cathepsin A to the oxidative stress response. J Proteome Res. 2016 Sep 2;15(9):3188-95
Petrera A, Kern U, Linz D, Gomez-Auli A, Hohl M, Gassenhuber J, Sadowski T, Schilling O
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Tenascin-C Orchestrates Glioblastoma Angiogenesis by Modulation of Pro- and Antiangiogenic Signaling. Cell Rep. 2016 Dec 6;17(10):2607-2619
Rupp T, Langlois B, Koczorowska MM, Radwanska A, Sun Z, Hussenet T, Lefebvre O, Murdamoothoo D, Arnold C, Klein A, Biniossek ML, Hyenne V, Naudin E, Velazquez-Quesada I, Schilling O, Van Obberghen-Schilling E, Orend G
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Proteomics highlights decrease of matricellular proteins in left ventricular assist device therapy. Eur J Cardiothorac Surg. 2017 Feb 20
Shahinian JH, Mayer B, Tholen S, Brehm K, Biniossek ML, Füllgraf H, Kiefer S, Heizmann U, Heilmann C, Rüter F, Grapow M, Reuthebuch OT, Eckstein F, Beyersdorf F, Schilling O, Siepe M
