Strukturelle und biochemische Analysen des Disproportionierungs-Isozyms 2 (DPE2)

• Antragsteller: Dr. Thorsten Mielke; Professor Dr. Christian M. T. Spahn
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 239353016

Der Stärkestoffwechsel in Pflanzen ist komplex und umfasst zahlreiche Stoffwechselwege zur Speicherung bzw. zum Abbau von Zuckern. Innerhalb einzelner Mesophyllzellen muß der Stärkestoffwechsel zusätzlich über die zahlreichen Plastiden integrieren, die sich sowohl in ihrer Größe als auch ihrem Stärkegehalt unterschieden, um neutrale Zucker in einen einheitlichen Reaktionsraum, dem Zytosol, zu exportieren. Das zentrale Element dieses komplizierten Netzwerks ist das Disproportionierungs-Isozym 2 (DPE2), das mit beta-Maltose das quantitativ wichtigste Abbauprodukt der Stärke-Mobilisierung umsetzt. DPE2 überträgt dabei einen Glucosylrest von beta-Maltose auf ein endogenes Heteroglycan und setzt den zweiten Hexosylrest als Glucose frei.DPE2 besteht aus einer einzelnen Polypetidkette mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 100 kDa. Im funktionell aktiven Zustand weist die DPE2 jedoch eine deutlich komplexere Quartärstruktur auf. In Höheren Pflanzen wie z.B. Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, Zea mays) kommt DPE2 als hochmolekularer Komplex mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 1 MDa vor (Zustand I) und auch rekombinant exprimiertes Protein nimmt diesen Zustand ein. In Präparationen von rekombinanter DPE2 sowie in aus verschiedenen Geweben von Arabidopsis wurde zusätzlich ein kleinerer oligomerer Komplex mit einem Molekulargewicht von ca. 300 kDa (Zustand II) nachgewiesen. Darüber hinaus enthält der hochmolekulare Zustand I endogene Kohlenhydrate, die möglicherweise als intrinsischer Akzeptor beim Glukosyltransfer dienen. Der genaue Reaktionsmechanismus dieses Schlüsselschritts im Stärkeabbau ist bis jetzt jedoch noch ungeklärt.Im Rahmen dieses Projekts wollen wir daher die strukturelle Organisation sowie den Reaktionsmechanismus der DPE2 mit einer Kombination aus biochemischen, kinetischen und molekularbiologischen Methoden mit Kryo-Elektronenmikroskopie und Röntgenkristallographie aufklären. Dazu wollen wir die Zusammensetzung der DPE2-Komplexe in verschiedenen Pflanzen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen untersuchen. Weiterhin wollen wir die physiologische Bedeutung der unterschiedlichen oligomeren Zustände der DPE2 sowie die funktionelle Rolle der endogenen Kohlenhydratkomponenten analysieren. Zusätzlich wollen wir durch Kombination von Kryo-Elektronenmikroskopie und Röntgenkristallographischen Methoden die Struktur von DPE2-Komplexen aufklären, um diese zentrale Schnittstelle des Zuckerstoffwechsels in Pflanzen auch auf molekularer Ebene zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen