TIRF-FRET-FRAP-Calcium-Imaging Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das TIRF-FRET-FRAP-Calcium-Imaging Mikroskop konnte erfolgreich zur in vitro Analyse intrazellulärer Calcium-Signale bei einzelnen Thrombozyten eingesetzt werden. Die untersuchten Thrombozyten zeigten eine ausgeprägte Phototoxizität, so dass eine sehr sensitive CCD-Kamera von Nöten war, um Calcium-Signale über 5 Minuten aufzunehmen. Mit Hilfe von Fura-2-AM konnten zum ersten Mal subzelluläre Calcium-Verteilungen und -Oszillationen von migrierenden Thrombozyten beobachtet werden. Ein Vergleich zu den sessilen Thrombozyten ergab eine polarisierte Calcium-Verteilung mit achtfach höheren Calcium- Amplituden. Somit konnte gezeigt werden, dass die bislang als nicht-migrierend bekannten Thrombozyten der Migration fähig sind. Damit können migrierende Thrombozyten in vivo Repositionierungen im noch nicht-konsolidierten Thrombus durchführen und sogar gezielt Bakterien bündeln. Des Weiteren konnte mit Hilfe des Mikroskops die subzelluläre Expressionsstärke von auf FRET-basierenden cAMP-Sensoren untersucht werden, die notwendig war für den systematischen Vergleich von cAMP-Senoren für eine valide und reliabele Detektion von intrazellulären cAMP-Abnahmen. Zudem konnte die dynamische NHERF-TRPC5-Interaktion mit diesem Mikroskop mittels FRET überprüft werden. Somit konnte der Aktivierungsmechanismus der Kationenkanäle TRPC4 und TRPC5 aufgeklärt werden. Des Weiteren konnte die Kompartiment-selektive Detektion von freiem Calcium im Sarkoplasma und in den Mitochondrien von Herzmuskelzellen überprüft werden. Es stellte sich hierbei heraus, dass die Doppelfärbung mit Fluo-4-AM und Rhod-2-AM keine Kompartiment-Selektivität bietet. Erst eine Rhod-2-AM Vorfärbung mit anschließender Fluo-4-Färbung über eine Patchpipette führte zu einem zufriedenstellenden Kompartiment-selektiven Anfärben. Diese Ergebnisse waren wichtige Voraussetzungen für die Untersuchung von mitochondrialen Calcium-Signalen in Herzmuskelzellen bei der catecholaminergen polymorphen ventrikulären Tachykardie.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2017) Migrating Platelets Are Mechano-scavengers that Collect and Bundle Bacteria. Cell 171 (6) 1368-1382.e23
Gaertner, Florian; Ahmad, Zerkah; Rosenberger, Gerhild; Fan, Shuxia; Nicolai, Leo; Busch, Benjamin; Yavuz, Gökce; Luckner, Manja; Ishikawa-Ankerhold, Hellen; Hennel, Roman; Benechet, Alexandre; Lorenz, Michael; Chandraratne, Sue; Schubert, Irene; Helmer,
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(2017) Suppression of Arrhythmia by Enhancing Mitochondrial Ca2+ Uptake in Catecholaminergic Ventricular Tachycardia Models. JACC. Basic to translational science 2 (6) 737–747
Schweitzer, Maria K.; Wilting, Fabiola; Sedej, Simon; Dreizehnter, Lisa; Dupper, Nathan J.; Tian, Qinghai; Moretti, Alessandra; My, Ilaria; Kwon, Ohyun; Priori, Silvia G.; Laugwitz, Karl-Ludwig; Storch, Ursula; Lipp, Peter; Breit, Andreas; Mederos Y Schni
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2017, Dynamic monitoring of Gi/oprotein-mediated decreases of intracellular cAMP by FRET-based Epac sensors; Pflügers Archiv
Storch et al.
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2017, Dynamic NHERF interaction with TRPC4/5 proteins is required for channel gating by Diacylglycerol, Proc Natl Acad Sci USA
Storch et al.
