Strukturelle und funktionelle Analyse von Apo-Konformationen des Modell Cys-loop-Rezeptors GluCl aus Caenorhabditis elegans

• Antragsteller: Dr. Thorsten Althoff
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie ; Biophysik ; Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2015
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 240621059

Neuronale Übertragung an chemischen Synapsen kann auf vielerlei Art und Weise durch die Wirkung von Neurotransmittern auf entsprechende Rezeptoren moduliert werden. Sogenannte Cys-loop-Rezeptoren gehören zu einer großen Familie von pentameren Liganden-gesteuerten Ionenkanälen die schnelle Neurotransmission vermitteln. Obwohl sie einen ähnlichen strukturellen Aufbau besitzen, können die Mitglieder der Familie je nach ihrer Ionenselektivität sowohl erregende, als auch hemmende Effekte bewirken. Aufgrund dieser weit verbreiteten Funktionen sind sie bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen involviert und dienen als Angriffspunkt für viele Medikamente und missbräuchliche Drogen.Trotz großer Fortschritte im Verständnis der Struktur und Funktion dieser Rezeptoren sind die Details zu Aktivierung und Öffnungsmechanismus noch wenig verstanden. Eine kürzlich veröffentlichte Struktur des Anionen-selektiven Cys-loop-Rezeptors GluCl aus Caenorhabditis elegans hat wichtige erste Erkenntnisse zum Mechanismus des Rezeptors geliefert. Trotzdem werden für ein umfassendes Verständnis weitere strukturelle Informationen zu verschiedenen Konformationen des Proteins benötigt. Die bisherigen Strukturen zeigen alle einen Liganden-gebundenen Zustand des Rezeptors. Insbesondere Kenntnis des Liganden-freien Apo-Zustandes des Proteins wird das Verständnis der strukturellen Veränderungen nach Aktivierung des Rezeptors beträchtlich erweitern. Ich möchte daher hoch aufgelöste Strukturdaten des Modellproteins GluCl in verschiedenen Konformationen erhalten. Vorläufige Ergebnisse deuten darauf hin, daß Lipide eine wichtige Rolle bei der Aktivierung des Rezeptors spielen. Ein Schwerpunkt des vorliegenden Antrags ist es deshalb die funktionelle und strukturelle Rolle von Lipiden im Kontext der Rezeptoraktivierung zu untersuchen. Da der partielle allosterische Agonist Ivermectin in der Transmembranregion des Rezeptors bindet, können strukturelle Informationen über die Interaktion mit natürlichen Modulatoren wie Lipiden auch bei der Entwicklung neuer Therapeutika helfen. Weiter will ich herausfinden, wie das Öffnen und Schließen der Kanalpore bewerkstelligt wird.Zu diesem Zweck werden große Proteinmengen von Wildtyp und von mittels Stellen-spezifischer Mutagenese erzeugter Mutanten heterolog in Insektenzellen exprimiert und mit Hilfe von Affinitäts- und Größenausschlußchromatographie zur Homogenität gereinigt. Homogenität und Stabilität des Proteins werden per Fluoreszenzdetektions-Größenausschlußchromatographie überprüft. Die Funktionalität des Proteins wird anhand von Radioligandenbindung, Zwei-Elektroden-Spannungsklemmen-Elektrophysiologie in Xenopus laevis Oozyten und Ionenflußmessungen an rekonstituierten Proteoliposomen getestet werden. Wenn ausreichende Mengen an homogenem und aktivem Protein verfügbar sind, werden Versuche zur 3D-Kristallisation der Mutanten in der Gegenwart von hohen Lipidkonzentrationen beginnen, um die Struktur mittels Röntgenbeugung zu bestimmen.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Professor Dr. Jeff Abramson; Dr. Eric Gouaux