Hochauflösendes Massenspektrometer mit uHPLC (A)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das hochauflösende ESI-Massenspektrometer mit vorgeschalteter nano-flow HPLC wurde verwendet, um aktuelle biologische Fragestellungen mit Hilfe der Proteomik zu beantworten. Das Gerät wurde sowohl von der Arbeitsgruppe „Chromatin Biology & Proteomics“ unter Leitung von Frau Dr. Petra Beli, als auch von der Proteomik Core Facility unter Leitung von Herrn Dr. Falk Butter betrieben. Die Arbeitsgruppe Beli nutzt Massenspektrometrie-basierte Proteomik um die Rolle der Protein-Ubiquitinierung und -Phosphorylierung in der Regulation der zellulären DNA-Schadensantwort zu untersuchen. Um eine systematische Untersuchung der zellulären Reaktion auf verschiedene Arten von DNA-Schäden zu erreichen, werden innovative Methoden zur Anreicherung von modifizierten Peptiden (TiO2-Chromatographie und Peptid-Immunopräzipitation) mit Methoden zur relativen und absoluten Quantifizierung (z.B. SILAC und TMT) kombiniert. Der Einsatz dieser Techniken ermöglichte uns zum Beispiel die zelluläre Antwort auf Replikationsstress zu charakterisieren und die Substrate der Proteinkinase ATR zu identifizieren. Des Weiteren haben wir in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Steve Jackson (University of Cambridge) die Rolle der Proteinubiquitinierung und der Ubiquitin-Ligasen CUL4 und RNF138 in der Reparatur von Doppelstrangbrüchen untersucht. Wir konnten zeigten, dass RNF138 und CUL4 die Assoziation von DNA-Reparaturfaktoren im Bereich der DNA-Schäden regulieren, und so eine wichtige Rolle in der Reparatur von DNA durch homologe Rekombination (HR) und nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) spielen. Abgesehen von den oben genannten Projekten wurde das Gerät bei zahlreichen Kooperationen mit Arbeitsgruppen an der Universität Mainz sowie an anderen deutschen Universitäten eingesetzt. Im Rahmen der Core Facility stand das Gerät weiteren Arbeitsgruppen zur Verfügung. Weil sich der überwiegende Nutzungskreis auf Einrichtungen in Mainz konzentriert, wurde der Service auch von Gruppen anderen deutschen Hochschulen in Anspruch genommen. Das Angebot umfasst neben klassischer qualitativer Proteinidentifizierung, auch quantitative Strategien (stable isotope labeling by amino acids in cell culture [SILAC] und reductive Dimethylierung [DML]). Zum Beispiel konnte durch die Arbeitsgruppe Roignant das Protein Spenito als neue Komponenten des m6A- Methyltransferasekomplexes identifiziert werden. Die Arbeitsgruppe Richly konnte durch proteomische Messungen Interaktionspartner des DDB1/CUL4- Subkomplexes bestimmen, sowie des Proteins ZRF1 aufklären. Als Serviceprojekt für das MPI für Chemie wurde das Instrument zur Bestimmung von Proteinfragmenten in atmosphärischen Aerosolpartikeln verwendet.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Neddylation promotes ubiquitylation and release of Ku from DNA-damage sites. Cell Rep. 2015 May 5;11(5):704-14
Brown JS, Lukashchuk N, Sczaniecka-Clift M, Britton S, le Sage C, Calsou P, Beli P, Galanty Y, Jackson SP
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p38- and MK2-dependent signalling promotes stress-induced centriolar satellite remodelling via 14-3-3-dependent sequestration of CEP131/AZI1. Nat Commun. 2015 Nov 30;6:10075
Tollenaere MA, Villumsen BH, Blasius M, Nielsen JC, Wagner SA, Bartek J, Beli P, Mailand N, Bekker-Jensen S
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Systematic E2 screening reveals a UBE2D-RNF138-CtIP axis promoting DNA repair. Nat Cell Biol. 2015 Nov;17(11):1458-1470
Schmidt CK, Galanty Y, Sczaniecka-Clift M, Coates J, Jhujh S, Demir M, Cornwell M, Beli P, Jackson SP
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(2016). ATR inhibition rewires cellular signaling networks induced by replication stress. Proteomics, 16, 402-16
Wagner SA, Oehler H, Voigt A, Dalic D, Freiwald A, Serve H, Beli P
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(2016). m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature 540:242-247
Lence T, Akhtar J, Bayer M, Schmid K, Spindler L, Ho CH, Kreim N, Andrade-Navarro MA, Poeck B, Helm M, Roignant JY
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Metaproteomic analysis of atmospheric aerosol samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2016; 408:6337-48
Liu F, Lai S, Reinmuth-Selzle K, Scheel JF, Fröhlich-Nowoisky J, Després VR, Hoffmann T, Pöschl U, Kampf CJ
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ZRF1 mediates Remodeling of E3 ligases at DNA lesion sites during Nucleotide Excision Repair. J Cell Biol. 2016 Apr 18
Ekaterina Gracheva, Shalaka Chitale, Thomas Wilhelm, Alexander Rapp, Jonathan Byrne, Jens Stadler, Rebeca Medina, M. Cristina Cardoso and Holger Richly
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HSP90 is necessary for the ACK1-dependent phosphorylation of STAT1 and STAT3. Cell Signal. 2017 Nov;39:9-17
Mahendrarajah N, Borisova ME, Reichardt S, Godmann M, Sellmer A, Mahboobi S, Haitel A, Schmid K, Kenner L, Heinzel T, Beli P, Krämer OH
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Nuclear organization of nucleotide excision repair is mediated by RING1B dependent H2A-ubiquitylation. Oncotarget, Volume 5 (12 March 2017)
Shalaka Chitale and Holger Richly
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Ubiquitylation of the acetyltransferase MOF in Drosophila melanogaster. PLoS One. 2017 May 16;12(5):e0177408
Schunter S, Villa R, Flynn V, Heidelberger JB, Classen AK, Beli P, Becker PB
