Hochdurchsatztechnologien zur Detektion von RNA Modifikationen

• Antragsteller: Professor Dr. Mark Helm
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 242474743

Reife RNAs enthalten eine Vielzahl modifizierter Nucleotide, die posttranskriptional durch spezifische Enzyme gebildet werden. Unser Wissensstand bezieht sich vor allem auf stabile RNAs mit hoher Kopienzahl wie tRNA, rRNA und snRNA, während zu weniger exprimierten RNAs wie mRNAs nur wenig über Art und Position von Modifikationen bekannt ist. Vor Kurzem hat sich eine neue Dimension in unserem Verständnis der Funktion von Modifikationen eröffnet, welche einen epigenetischen Charakter impliziert. Neue Erkenntnisse stellen das etablierte Konzept eines stabilen, beständigen und lebenslangen Charakters von Modifikationen in Frage, und implizieren stattdessen transiente Modifikationen mit einer Rolle in Genregulation und einer Bedeutung die potentiell diejenige von alternativem Splicing erreichen kann. Hochrangige Publikationen haben sowohl einen regulatorischen, als auch einen regulierten Charakter von Modifikationen untermauert. Außer für mRNA trifft dies auch für die bisher als statisch geltenden tRNAs zu. Trotz einer Schlüsselrolle dieser Modifikationen ist generell wenig über Vorhandensein und Position in anderen RNAs bekannt. Die jüngsten Durchbrüche, die durch die Anwendung von Massenspektrometrie und RNA-Seq möglich wurden, sind zudem auf wenige Modifikationen beschränkt. Es herrscht Konsensus, dass die aktuell limitierenden Faktoren zweierlei sind, nämlich (i) die Bestimmung der chemischen Struktur von Modifikationen, sowie (ii) die Kartographierung ihrer Positionen in RNA Sequenzen. Derzeit ist die Analytik von individuellen RNA Spezies eine schwierige und arbeitsreiche Aufgabe, die insbesondere durch die benötigte Menge an purer RNA erschwert wird. Daher zielt dieses Projekt auf die Entwicklung neuer Hochdurchsatz-Technologien zur Detektion von RNA Modifikationen. Als zentrale Strategie werden wir zwei aktuelle Prinzipien kombinieren, nämlich selektive chemische Derivatisierung und die Blockade der reversen Transkription (RT). RNAs mit bekannten Modifikationsmustern werden mit verschiedenen Reagenzien behandelt, von denen bekannt ist, oder vermutet wird, dass sie Modifikationen chemisch selektiv derivatisieren und damit deren Verhalten während der RT in charakteristischer Weise verändern. Dies wird genutzt, um eine entsprechende charakteristische RT-Signatur der Modifikation in RNA-Seq Daten zu identifizieren. Diese Signatur wird dann angewandt, um Positionen potentieller Modifikationen in transcriptomweiten RNA-Seq Daten zu identifizieren. Zur Validierung solcher Kandidaten werden RNAs mit der entsprechenden Signatur durch roboterunterstützte, automatisierte Technologie in Mengen isoliert, die für eine Analyse durch LC-MS/MS ausreichend sind, um somit das Vorhandensein der vorhergesagten Modifikationen direkt zu bestätigen. Ziel des Projektes ist somit transcriptomweite Analysen bestimmter Modifikationen zu entwickeln, um diese später auf globale Änderungen von Modifikationsmustern in Entwicklungsbiologie und Pathologien ausdehnen zu können.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Frankreich
• Partnerorganisation: Agence Nationale de la Recherche / The French National Research Agency
• Beteiligte Person: Professor Dr. Yuri Motorin