Erzeugung einer thermostabilen Transketolase durch gelenkte Evolution: neue stereoselectivität, neue Substrattoleranz, neue Produktbandbreite

• Antragsteller: Professor Dr. Wolf-Dieter Fessner
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 242577053

Regioselektivität, Chemoselektivität und Stereoselektivität stellen traditionelle Methoden der Organischen Chemie im Bereich der Polyole und Kohlenhydrate vor inherente Herausforderungen, was die Anwendung anspruchsvoller Schutzgruppenstrategien erfordert, um ungewünschte Nebenreaktionen zu vermeiden. Im Gegensatz dazu kann beim Einsatz von Biokatalysatoren auf Schutzgruppen verzichtet werden, was oft die Anzahl der Syntheseschritte verringert und milde Reaktionsbedingungen erlaubt. Das beantragte Projekt beschäftigt sich mit der Transketolase (TK), einem Thiamindiphosphat-abhängigen Enzym, das eine hoch stereoselektive C-C-Bindungsbildung katalysiert und dabei in einem Schritt zu chiralen Ketosen führt. TK-Enzyme sind hoch spezifisch für Ketol-Donorsubstrate, stereospezifisch und enantioselektiv.Das Ziel dieses Projekts ist die Entwicklung neuartiger TK- Enzymvarianten durch Protein-Engineering in vitro für neue Syntheseanwendungen in vier Richtungen:(i) veränderte Stereoselektivität(ii) veränderte Donorspezifizität(iii) veränderte Akzeptortoleranz(iv) neue Reaktionskaskaden zur beschleunigten Synthese neuer chiraler Produkte. Das Projekt basiert auf einer neuen thermostabilen TK aus G. stearothermophilus, die im Vergleich zu bisherigen Enzymen besondere Vorteile für Anwendungen in der präparativen Biokatalyse verspricht.Die Erzeugung von TK-Varianten mit neuen Eigenschaften erfordert Proteinveränderungen unterschiedlicher Komplexität durch Mutagenese im aktiven Zentrum. Im Ergebnis versprechen wir uns einen Beitrag leisten zu können zur Einschätzung von Methoden des Protein-Engineering, die insbesondere bei weniger gut studierten Enzymen im Bereich der Carboligation angewendet werden können. Das Screening auf verbesserte Varianten wird in drei Stufen durchgeführt: 1) katalytische Aktivität wird analysiert in einem Hochdurchsatz-fähigen pH-abhängigen Assayformat, das von beiden Partnern gemeinsam entwickelt und validiert wurde; 2) Syntheseaktivität der Klone wird durch Analyse auf spezifische Produktbildung bestimmt; 3) positive Klone werden auf ihre Stereoselektivität untersucht.Weitere Entwicklungen zielen auf die Integration der Carboligation mit optimierten TK-Varianten zu innovativen Kaskadenreaktionen, z.B. durch in situ-Kupplung mit der Substratsynthese und/oder gezielter Produktveränderung.Dieses Projekt ist multidisziplinär aufgebaut mit Aspekten der Asymmetrischen Synthese, chiraler Analytik, Molekularbiologie und Enzymtechnologie, und fusst auf der komplementären Expertise des französischen Partners in Enzymologie/Screening/Mutagenese sowie des deutschen Partners in Assaytechnologie, Mutantencharakterisierung zur Substrattoleranz, Stereoselektivität und Synthesepotential. Die Effizienz des Konsortiums konnte bereits im Rahmen eines früheren ANR/DFG-Projekts (deoTK) belegt werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Frankreich
• Partnerorganisation: Agence Nationale de la Recherche / The French National Research Agency
• Beteiligte Person: Professorin Laurence Hecquet, Ph.D.