TIRF-Mikroskop mit FRET
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Mitte Dezember 2013 gelieferte Mikroskop ist mit der Internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (eng. Abk. TIRFM) Technologie ausgerüstet, die die Laserbeleuchtung von Fluoreszenzfarbstoffen in der Probe auf ca. 200 nm von der Glas/Proben Grenzfläche beschränkt. Somit erhält man Bilder der Zellen mit einem verbesserten Signal/Rausch Verhältnis für Objekte, die sich in der Nähe des Deckglases befinden und zusätzlich eine stark verbesserte Auflösung entlang der optischen Achse. Das Mikroskop dient also vornehmlich der Echtzeitaufnahme von Ereignissen, die an der Plasmamembran von Zellen stattfindet. Darüber hinaus ist die Tiefe des Beleuchtungsfeldes von der Laser Wellenlänge abhängig. Um also unterschiedliche Fluorophore gleichmäßig zu beleuchten, muss die Ankopplung der Laser in dem Mikroskop je nach Wellenlänge separat eingestellt werden können. Das wird von unserm Mikroskop gewährleistet, wodurch es sich besonders gut für mehrfarbige Aufnahmen eignet. Schließlich ist das Mikroskop mit einem sogenannten Autofokus ausgestattet, der jeglichen Fokusverlust ausgleicht. Das Gerät ist deshalb für Langzeitaufnahmen von über 15 Minuten besonders geeignet. Diese Eigenschaften des Mikroskops kamen besonders bei der Untersuchung von Exozytose bzw. Endozytose von T-Zellen zur Geltung. Dabei wurden die Fusionsereignisse lytischer Granula, welche z.B. durch Expression von Granzyme B-mCherry rot gefärbt sind, beobachtet und mit anderen Ereignissen, wie der Migration anderer Vesikelpopulationen oder der Position von beteiligten Proteinen korreliert. Wir erforschten u.a. die Rolle von VAMP8 in der Sekretion lytischer Granula von Maus und Mensch oder das Recycling von Synaptobrevin2, welches eine Komponente der Membran lytischer Granula ist. Zurzeit wird der Messstand zur Untersuchung von weiteren Proteinen, die möglicher Weise die Exozytose lytischer Granula steuern könnten, eingesetzt. Ein anderes Projekt, das sehr stark von den Eigenschaften dieses Messstandes profitiert, ist die Erforschung der Rolle von sogenannten „priming“ Faktoren, die die Exozytose synaptischer Vesikel begünstigen. Insbesondere interessiert uns dieser Prozess im Bereich von Wachstumskegeln in Neuronen der Spinalganglien. Bekannt ist, dass zwei unterschiedliche Typen von Vesikeln an dem Wachstum teilhaben. Die Frage, die wir beantworten wollen ist, ob deren Exozytose von unterschiedlichen Primingfaktoren oder allgemeiner von unterschiedlichen SNARE und/oder SNARE-assoziierten Proteinen reguliert wird. Nach einer Phase von einem Jahr, in der Funktionsfehler des Mikroskops beseitigt werden mussten und die Nutzbarkeit stark eingeschränkt war und einer weiteren Einarbeitungsphase mit mittlerer Auslastung, ist das System seit 2016 maximal ausgelastet.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2015) VAMP8-dependent fusion of recycling endosomes with the plasma membrane facilitates T lymphocyte cytotoxicity. J Cell Biol. 210:135-51
Marshall MR, Pattu V, Halimani M, Maier- Peuschel M, Müller ML, Becherer U, Hong W, Hoth M, Tschernig T, Bryceson YT, Rettig J
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(2016) Endocytosis of Cytotoxic Granules Is Essential for Multiple Killing of Target Cells by T Lymphocytes. J Immunol. 197(6):2473-84
Halimani M, Cordat E, Krause E, Rettig J, Pattu V
