Verbesserte Transgenexpression in pluripotenten Stammzellen und aus ihnen abgeleiteten Geweben durch den Einsatz von Ubiquitous Chromatin Opening Elements (UCOE)

• Antragsteller: Professor Dr. Thomas Moritz
• Fachliche Zuordnung: Hämatologie, Onkologie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 244040345

Für die stabile genetische Modifizierung pluripotenter Zellen wie Embryonaler Stamm (ES)- oder induzierter Pluripotenter Stamm (iPS)-Zellen sowie deren differenzierten Tochterzellen stellt das Silencing von Transgenen ein erhebliches Problem dar. Unsere Arbeitsgruppe konnte in einer aktuellen Proof-of-Principle Studie nachweisen, dass Ubiquitous Chromatin Opening Elements (UCOE) und insbesondere das vom humanen HNRPA2B1/CBX3-Locus abgeleitete A2UCOE hier einen Lösungsansatz darstellen. Diese Elemente können im murinen Modell die Transgenexpression in undifferenzierten ES/iPS-Zellen, besonders aber in deren hämatopoetisch differenzierten Tochterzellen, signifikant stabilisieren. Die hier beantragten Untersuchungen sollen nun in geeigneten in vitro-Modellen die Übertragbarkeit dieses Ansatzes auf humane ES/iPS-Zellen und deren mesodermale Differenzierung (hämatopoetisch und kardial) sowie auf alternative murine Differenzierungswege (neuronal, hepatisch, kardial) überprüfen. Außerdem soll die Wirksamkeit der A2UCOE im Rahmen der in vivo-Differenzierung von ES/iPS-Zellen während der Embryogenese in einem etablierten tetraploiden Komplementierungsmodell evaluiert werden. Ergänzend zu diesen vorwiegend anwendungsorientierten Untersuchungen sollen aber auch die molekularen Grundlagen des stabilisierenden Einflusses von UCOEs auf die Transgenexpression aufgeklärt werden. Hierzu sollen zum einen die Struktur-Wirkungsbeziehungen in UCOEs unter Einsatz von Deletions- bzw. Substitutions-Mutanten des A2UCOEs untersucht werden, zum anderen soll in definierten Integrationsklonen der Einfluss der viralen Integrationsstelle und deren epigenetischer Umgebung auf die Wirksamkeit des A2UCOEs analysiert werden. Neben einer Analyse von ES/iPS-Zellklonen mit zufälligen Integrationsstellen sollen hier auch mittels Flip-Rekombinase mediiertem Kassettenaustausch (FRMCE) generierte Klone untersucht werden, bei denen die verschiedenen A2UCOE-Vektorkonstrukte im gleichen Genlocus integriert sind. Beabsichtigt ist hier der Vergleich von je zwei Integrationsstellen in physiologischerweise transkriptionell inaktiven Heterochromatin-Bereichen bzw. in Euchromatin-Bereichen in der Nähe des Transkriptionsstarts von aktiv transkribierten Genen. Ein erfolgreicher Abschluss des hier vorgeschlagenen Projekts würden zum einen eine breit einsetzbare Technologie zur Vermeidung des Transgen-Silencings in pluripotenten Zellen und deren Tochtergeweben etablieren und hätten somit unmittelbare praktische Bedeutung für das gesamte Feld der Generierung transgener Zelltherapeutika aus pluripotenten Ausgangspopulationen. Zum anderen würden die hier vorgeschlagenen Untersuchungen unser Verständnis der molekularen und speziell der epigenetischen Grundlagen der Wirksamkeit von UCOEs erweitern und somit langfristig auch einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen und epigenetischen Mechanismen leisten, die für das Silencing von Transgenen nach retroviralem Gentransfer verantwortlich sind.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen