Molekularer Mechanismus der U1 snRNP-vermittelten Unterdrückung der 3 strich Endprozessierung

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Jens Bohne
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 244876233

Die Regulation der Genexpression ist der Schlüssel, um die heutige Menge an Sequenzinformationen zu deuten. RNA ist dabei das zentrale Molekül. In den letzten Jahren zeigte sich, dass sowohl alterna-tive mRNA-Prozessierung als auch nicht-kodierende RNAs substantiell zur Komplexität des Genoms beitragen. Kürzlich wurde beschrieben, dass die alternative Nutzung von Polyadenylierungssignalen (PAS) noch häufiger als alternatives Spleißen ist. Im Umkehrschluss ist damit die Heterogenität des 3/ Endes von mRNAs wichtig für die Genregulation. Erstens führt die Auswahl verschiedener terminaler Exons zu unterschiedlichen C-Termini von Proteinen und zweitens finden sich bei unterschiedlicher Länge der 3/ untranslatierten Regionen (UTR) mehr oder weniger Bindungsstellen für miRNAs oder andere Se-quenzmotive, welche RNA-Stabilität oder Lokalisation regulieren. Darum ist alternative Polyadenylie-rung (APA) strikt reguliert. Interessanterweise wurde kürzlich für U1 snRNP gezeigt, dass es, zusätzlich zu seiner Funktion im Spleißen, mRNAs vor premature cleavage and polyadenylation (PCPA) schützt UND zu unterschiedlichen 3/UTR-Längen führt. Parallel zur Entdeckung dieses neuen Kontrollmechanismus haben wir den molekularen Pathome-chanismus einer zuvor unklassifizierten 3/UTR-Mutation aufgeklärt, welche zu einer neuen, komplexen Immundefizienz führt. Eine Punktmutation in der 3/UTR des Gens p14/robld3 schafft eine 5/ Spleißstelle (SS), welche U1 bindet und spleiß-unabhängig die 3/ Endprozessierung hemmt. Somit ist die Unterdrückung von intronischer Polyadenylierung wichtig für die Zelle, aber schädlich für die p14-Expression.Bisher wurde angenommen, dass die U1-Untereinheit U1-70k direkt die Poly A Polymerase hemmt. Wir konnten zeigen, dass U1 die Spaltung der RNA verhindert. Entweder durch eine direkte Interaktion mit dem 3/ Endprozessierungskomplex oder durch Veränderungen an der RNA polymerase II selbst. Um den Mechanismus aufzuklären, haben wir einen Tandem-Reporter kloniert, der eine Duplikation der p14-3/UTR enthält. Darüber hinaus haben wir Erfahrung mit einem bi-direktionalen Tet System. Der symetrische, Dox-induzierbare Promotor exprimiert gleichzeitig ein Normalisierungs-Gen und die p14-Kassette. Dieses Konstrukt kann durch Rekombination in einen vorher ausgewählten genomischen Lokus eingebracht werden. Eine Vielzahl experimenteller Fragen lassen sich mit diesen Systemen beantworten, wie etwa welcher RNA-Abbauweg greift oder welche U1-Untereinheit die PAS-Unterdrückung vermittelt. Basierend auf eigenen Arbeiten mit einem Histone-Reporter, schlagen wir vor, dass U1 schon die Erkennung eines PAS inhibiert oder einen Spaltungsfaktor negativ beeinflusst. Die molekulare Analyse dieser zusätzlichen U1 snRNP-Funktion wird unser Verständnis des zugrun-deliegenden zellulären Kontrollmechanismus haben, welcher mRNAs genom-weit vor vorzeitiger Transkriptionstermination schützt, aber eben auch zur Vielfalt von RNA-Molekülen beiträgt.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen