Analyse der molekularen Funktionen des Ubiquitin-artigen Atg8 bei der Autophagosomen-Biogenese in S. cerevisiae

• Antragstellerin: Dr. Roswitha Krick
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 244994940

Durch den hochkonservierten autophagischen Transport gelangen bei Nährstoff-Mangel zytosolisches Material oder ganze Organellen zum Abbau in die Vakuole. Aus der preautophagosomalen Struktur (PAS) bilden sich Doppelmembran-lagige Vesikel, die sogenannten Autophagosomen. Diese fusionieren schliesslich mit der Vakuole, wobei sie das von einer Membran umschlossene autophagische Vesikel (autophagic body) in das Lumen der Vakuole entlassen. Dieses wird letztendlich abgebaut und seine Bestandteile wiederverwendet. Woher die Membranen für die Biogenese der Autophagosomen stammen, ist eine der zentralen offenen Fragen der Autophagie. In S. cerevisiae transportiert das integrale Membranprotein Atg9 wohl nur etwa 2% der benötigten Membranoberfläche von einer nicht-PAS Struktur zum PAS. Zusätzliche Membranquellen müssen daher noch unbekannt sein. Das Ubiquitin-ähnliche Atg8 Protein ist eine zentrale Komponente der Autophagie-Maschinerie und der Autophagosomen-Biogenese. Es wird ähnlich wie Ubiquitin durch ein Kopplungs-System kovalent an Phosphatidylethanolamin und damit an eine Membran gebunden. Das Atg8 Konjugationssystem ist jedoch einzigartig, da es nicht die Kopplung an ein Protein sondern ein Lipid bewirkt. Erste unveröffentlichte eigene Vorarbeiten weisen auf die Existenz von Atg8 an einer nicht-PAS Struktur hin. Das erste Ziel dieses Antrags ist die genaue Analyse dieser nicht-PAS Struktur von Atg8 und einer vermuteten Rolle von Atg8 im vesikulären Membrantransport zum PAS. Der zweite Teil dieses Antrags konzentriert sich auf die Funktion von Atg8 bei Membranfusionen, die während der Entstehung von Autophagosomen ablaufen. Atg8 besteht aus einer N-terminalen Helix-förmigen Domäne (NHD) und einer Ubiquitin-ähnlichen Domäne (ULD). Es unterscheidet sich von Ubiquitin hauptsächlich aufgrund dieser NHD, die entscheidend für die Funktion von Atg8 ist. Eigene publizierte Daten stellen eine Verbindung zwischen der NHD und der Membranfusions-Funktion während der Autophagosomen-Biogenese her. Die Rolle der NHD von Atg8 soll eingehender analysiert werden. Die Aufklärung des Elongations- und Verschluss-Mechanismus würde einen erheblichen Fortschritt im Verständnis der Autophagosomen-Biogenese bedeuten, einer weiteren Herausforderung auf dem Gebiet der Autophagie.Aufgrund der bisherigen Datenlage bildet Atg8 mehrere Subkomplexe, die räumlich und zeitlich versetzt für verschiedene Schritte der Autophagosomen-Biogenese benötigt werden. Die Isolation von Atg8 Komplexen mit Standard-Methoden würde keine Zuordnung neu identifizierter Komponenten zu einem dieser co-existierenden Komplexe erlauben. Daher sollen die verschiedenen Subkomplexe durch native Elektrophoresen (Blue Native PAGE) aufgetrennt werden, um die lokalen und zeitlichen Unterschiede in der Sub-Komplexzusammensetzung zu untersuchen. Dadurch sollte die Erstellung eines ersten Models für die Umformung der Subkomplexe im Zeitverlauf und die Änderung ihrer Lokalisation ermöglicht werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Niederlande
• Beteiligte Personen: Professor Dr. Andreas Janshoff; Professor Dr. Fulvio Reggiori