Nano-HPLC gekoppeltes Massenspektrometer
Final Report Abstract
• In 8 Immunopräzipitaten, die mit einem Antikörper gegen GFP auf Extrakten von Arabidopsis Wildtyp und einer GUN1-GFP überexprimierenden Linie generiert wurden, konnten wir mit dem Massenspektrometer insgesamt 271 Proteine identifizieren. 22 von diesen erfüllten die Kriterien einer mindestens 1.5-fachen Anreicherung in GUN1-GFP-Linien gegenüber dem Wildtyp und einem P Wert von < 0.05. Viele dieser 22 Proteine sind an der plastidären Translation und Protein- Homöostase beteiligt und legen nahe, dass GUN1 Teil eines Netzwerkes ist, das zur plastidären Protein-Homöostase beiträgt. • In 8 Immunopräzipitaten, die mit einem Antikörper gegen HSP22E/F auf Extrakten von unbehandelten und hitzegestressten Chlamydomonas-Zellen generiert wurden, konnten wir mit dem Massenspektrometer insgesamt 168 Proteine identifizieren. 39 von diesen konnten mit Hilfe eines neuen Algorithmus mit P score < 0.05 als sichere HSP22E/F-Interaktoren identifiziert werden. Sehr viele dieser offenbar thermolabilen Proteine sind Schlüsselenzyme von energieintensiven Prozessen. Dies legt nahe, dass ihre Thermolabilität erwünscht ist, um rasch nach Einsetzen von Hitzestress energieaufwendige Stoffwechselwege abzuschalten um Energie für Akklimatisierungsprozesse verfügbar zu haben. • Um Wirtspflanzen wie die Tomate zu infizieren sekretiert der Pilz Botrytis cinerea eine Batterie an Proteinen. Ebenso sekretiert der Wirt Proteine zur Abwehr. Botrytis velvet-Mutanten zeigen verringerte Virulenz gegenüber dem Wirt. Mit Massenspektrometrie konnten wir 164 sekretierte und 10 zelluläre Botrytis-Proteine sowie 49 sekretierte und 92 zelluläre Tomatenproteine im Sekretom identifizieren. Durch Markierung von Tomatenpflanze und Botrytis-Pilz mit dem schweren 15N-Isotop und Massenspektrometrie konnten wir außerdem zeigen, dass velvet-Mutanten insgesamt weniger Proteine sekretieren, darunter vor allem Proteasen und Enzyme, die pflanzliche Zellwände abbauen. • Mit Hilfe sogenannter QconCAT-Proteine und Massenspektrometrie konnten wir die Proteine und Proteinkomplexe der photosynthetischen Lichtreaktionen und des Calvin-Benson-Zyklus in Chlamydomonas absolut quantifizieren und Regeln zum Design eines QconCAT-Proteins aufstellen. • Anhand der QconCAT-Daten konnte ein auf künstlicher Intelligenz beruhender Algorithmus etabliert werden, mit dem die Eignung eines Peptids für die absolute Quantifizierung des zugehörigen Proteins mittels Massenspektrometrie vorhegesagt werden kann. • Das plastidäre Chaperonin in Chlamydomonas besteht aus insgesamt 14 alpha, beta1 und beta2 Untereinheiten. Ebenfalls mit Hilfe eines QconCAT-Proteins und Massenspektrometrie konnten wir die Stöchiometrie der drei Untereinheiten mit 6:2:6 bestimmen. Diese spezielle Mischung scheint für die Faltung bestimmter Proteine im Chloroplasten abgestimmt zu sein.
Publications
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(2019) Hetero-oligomeric CPN60 resembles highly symmetric group-I chaperonin structure revealed by Cryo-EM. The Plant journal : for cell and molecular biology 98 (5) 798–812
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