Laser-Mikrodissektionssystem
Zusammenfassung der Projektergebnisse
MicroRNAs sind kurze, nicht für Proteine kodierende Nukleotide, die durch Hemmung der Proteinsynthese auf posttranskriptioneller oder translationaler Ebene die Funktion und den Phänotyp von Zellen regulieren. Atherosklerotisch verengte Arterien werden häufig durch eine Stentimplantation behandelt, bei der die Engstelle durch mechanischen Druck aufgedehnt wird. Bei dieser Behandlung kommt es zu einer Verletzung der Gefäßwand, die von den glatten Muskelzellen (Smooth muscle cells, SMCs) ausgehende Reparaturvorgänge zur Folge hat. Die Reparaturvorgänge, im wesentlichen durch eine Neointimabildung aufgrund Proliferation der SMCs gekennzeichnet, können zu einer erneuten Verengung des betroffenen Gefäßes führen (Restenose). Bei diesem Prozess der SMC Proliferation spielen microRNAs eine wichtige Rolle. In einem Mausmodell der arteriellen Gefäßreparatur haben wir durch genetische Veränderung die Rolle der microRNA Biogenese in SMCs auf die Neointimabildung untersucht. Wir konnten zeigen, dass ein Knockout des Enzyms Dicer, das für die Reifung der microRNAs essentiell ist, in SMCs zu einer vermehrten Neointimabildung durch SMC Proliferation führt. Um nachzuweisen, dass der Knockout des Dicer-Gens nach Induktion durch Tamoxifen-Gabe und Aktivierung der Cre-Rekombinase spezifisch in SMCs und nicht in Endothelzellen auftritt, wurde mittels Lasermikrodissektion aus histologischen Schnitten die medialen SMCs und die Endothelzellen getrennt aus der gleichen Arterie von Tamoxifen-behandelten Mäusen, die eine Tamoxifen-aktivierbare Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines SMC-spezifischen Gens (MYH11) exprimieren, ausgeschnitten. Es wurden Mäuse mit dem Wildtyp Dicer-Gen und Mäuse mit einem „gefloxten“ Dicer-Gen (das gefloxte Gen wird durch die Cre-Rekombinase ausgeschnitten) untersucht. Aus den mittels Lasermikrodissektion gesammelten Proben wurde RNA isoliert und mittels quantitativer RT-PCR die Genexpression von Dicer in SMCs und Endothelzellen quantifiziert. Wir konnten nachweisen, dass in Mäusen mit dem „gefloxten“ Dicer-Gen in medialen SMCs deutlich weniger Dicer mRNA bilden als Mäuse mit dem Wildtyp Dicer-Gen. Ferner haben wir festgestellt, dass demgegenüber in Endothelzellen kein Unterschied in der Dicer Expression zwischen den beiden Gruppen von Mäusen vorhanden ist. Damit konnten wir zeigen, dass wir einen spezifischen Knockout des Dicer Gens in SMCs induziert haben. Die weiteren Experimente ergaben, dass Dicer unter anderem durch die Bildung der microRNA miR-27a die SMC Proliferation verringert, da miR-27a die Übertragung von Wachstumssignalen in SMCs hemmt. In einer weiteren Studie haben wir die Rolle der miR-155 bei der Funktion der Inselzellen im Pankreas in hyperlipidämischen Mäusen untersucht. Mittels Lasermikrodissektion haben wir aus dem Pankreas Inselzellen von Mäusen, die mit einer normalen oder einer diabetogenen Diät über 24 Wochen gefüttert wurden, isoliert. In diesen Proben wurde die Expression der miR-155 quantifiziert. Wir konnten zeigen, dass die diabetogene Diät zu einer gesteigerten Expression in Inselzellen des Pankreas führt. Diese Ergebnisse trugen zur Identifizierung der Rolle der miR-155 in der Antwort von beta-Zellen auf hyperlipidämischen Stress bei. Wir konnten zeigen, dass die Hyperlipidämie-induzierte miR-155 Expression in beta-Zellen die Insulin-Sekretion durch die Hemmung der Bildung des Transkriptionsfaktors MafB fördert. MafB wiederum hemmt die Bildung von Interleukin-6, das eine protektive Steigerung der GLP-1 Produktion in alpha-Zellen vermittelt. In einer dritten Studie haben wir die Funktion der miR-21 in Makrophagen bei der Entstehung von atherosklerotischen Plaques in einem Mausmodell untersucht. Mäuse mit einem Knockout des miR-21 Gens in Knochenmarkzellen wurden verglichen mit Mäusen die das miR-21 in Knochenmarkszellen exprimieren. Da Makrophagen aus Knochenmarkszellen gebildet werden, haben wir in diesem Modell im wesentlichen den Einfluss der miR-21 in Makrophagen untersucht. Wir konnten zeigen, dass ein Knockout des miR-21 Gens in Knochenmarkszellen zu einer verringerten atherosklerotischen Plaquebildung führt. Dies war verbunden mit einer Veränderung der Expression von molekularen Uhrengenen in Makrophagen. Um diesen Effekt in vivo genauer zu Untersuchen, haben wir mittels Lasermikrodissektion Makrophagen aus den Plaques ausgeschnitten und die Genexpression von Uhrengenen quantifiziert. Wir fanden, dass der Knockout von miR-21 zu einer gesteigerten Expression von Uhrengenen, wie Arntl und Nfil3, während das Uhrengen Per2 herunterreguliert war. Ferner konnten wir zeigen, dass das proapoptotische Gen Xaf1 in Plaque-Makrophagen hochreguliert war in der Abwesenheit von miR-21.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Dicer generates a regulatory microRNA network in smooth muscle cells that limits neointima formation during vascular repair. Cell Mol Life Sci. 2017;74:359-372
Zahedi F, Nazari-Jahantigh M, Zhou Z, Subramanian P, Wei Y, Grommes J, Offermanns S, Steffens S, Weber C, Schober A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00018-016-2349-0) - Hyperlipidemiainduced MicroRNA-155-5p improves beta-cell function by targeting Mafb. Diabetes. 2017;66:3072-3084
Zhu M, Wei Y, Geissler C, Abschlag K, Campos JC, Hristov M, Moellmann J, Lehrke M, Karshovska E, Schober A
(Siehe online unter https://doi.org/10.2337/db17-0313)
