Strukturelle Mechanismen von Roquin-RNA-Interaktionen im Zusammenhang mit Autoimmunität
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Protein Roquin hat eine zentrale Rolle bei der Regulation von Mengen an Boten-RNA (mRNA) u.a. der T-Zell-Ko-Rezeptoren ICOS und Ox40, die eine wichtige Rolle in Autoimmunität und T-Zell-Differenzierung spielen. Roquin besteht aus drei Domänen und einem großen unstrukturierten Bereich für die Rekrutierung von Proteinen des mRNA-Abbaus. Roquin-ZielmRNAs tragen ein sogenanntes ‚constitutive decay element‘ (CDE), eine Haarnadel-Struktur von etwa 20 Nukleotiden mit einem charakteristischen Dreier-Loop, welche sich für gewöhnlich im 3‘-untranslatierten Bereich (UTR) der Ziel-mRNA befindet. Wie genau Roquin Ziel-mRNA-Motive erkennt, war lange unbekannt. In dieser Arbeit gelang die Strukturaufklärung aller drei Roquindomänen, d.h. der RING- und Zinkfingerdomänen (jeweils mittels Kernmagnetresonanzspektroskopie, NMR) sowie v.a. der neu definierten ROQ-Domäne (Röntgenkristallographie). Die proteinbindende RING-Domäne klassifiziert Roquin als E3-Ligase in Ubiquitierungssignalwegen, und die ermittelte Struktur offenbart eine seltene Koordination von Zink über einen Aspartatrest. Die Untersuchung des Zinkfingers ergab eine unerwartete, für die Integrität der Struktur notwendige, carboxyterminale helikale Erweiterung. Die ROQ-Domäne bildet die zentrale RNA-bindende Einheit und konnte sowohl allein als auch im Komplex mit einem CDE atomar aufgelöst werden. Die Definition der stabilen Kern-ROQ-Domäne gelang zuvor ausschließlich über limitierte Proteolyse. Die ROQ-Domäne wurde detailliert mittels NMR, Kleinwinkelröntgenstreuung und in Bindungsexperimenten/Mutationsanalysen charakterisiert und erstmals der Beweis erbracht, dass Roquin für funktionale Kompetenz in Zellen direkt mit RNA interagieren muss. Darüber hinaus erfolgten eine Aufweichung des von Roquin erkannten CDE-Konsensusmotivs und der Nachweis, dass auch die Gegenwart von CDE-ähnliche Elementen zu mRNA-Regulation von ICOS und Ox40 durch Roquin in Zellen führt. Zudem konnte in Zusammenarbeit mit kooperierenden Arbeitsgruppen durch ein SELEX-Experiment (Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) mit Roquin ein neues, Uridin-reiches Haarnadelmotiv mit sechs ungepaarten Basen identifiziert werden, welches als ‚alternative decay element‘ (ADE, alternatives mRNA-Abbauelement) von Roquin erkannt wird. Ein ADE-ähnliches Motiv im 3’UTR der Ox40-mRNA mitwirkt zeigt dabei additive repressive Wirksamkeit zusammen mit dem CDE-ähnlichen Motiv. Wir präsentieren dazu kristallographische, NMR- und funktionale Daten, die eine dem CDE analoge Interaktion und Regulation im ADE belegen. Im Falle des Ox40 3’-UTR erfolgt diese Regulation additiv mit dem CDE-ähnlichen Motiv. Diese Studie zeigt damit die unerwartete mögliche Breite an Roquin-Zielsequenzen und ihre gemeinsame regulatorische Funktion als cis-Elemente in der Repression von mRNAs und erweitert die zentrale Rolle des Proteins in post-transkriptioneller Regulation bisher unbekannter Ziel-mRNAs.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Structural basis for RNA recognition in roquin-mediated post-transcriptional gene regulation. Nat Struct Mol Biol. 2014 Aug;21(8):671-8
Schlundt A, Heinz GA, Janowski R, Geerlof A, Stehle R, Heissmeyer V, Niessing D, Sattler M.
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RNA recognition by Roquin in posttranscriptional gene regulation. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2016 Feb 4
Schlundt A, Niessing D, Heissmeyer V, Sattler M
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Roquin recognizes a non-canonical hexaloop structure in the 3‘-UTR of Ox40. Nat Comm. 2016
Janowski R, Heinz GA, Schlundt A, Wommelsdorf N, Brenner S, Gruber AR, Blank M, Buch T, Buhmann R, Zavolan M, Niessing D, Heissmeer V, Sattler M
