Entwicklung einer Biochip-Technologieplattform für simultane Genexpressions- und Mutationsanalyse
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Einen wesentlichen Fortschritt für die diagnostische Biochiptechnologie stellt die Entwicklung einer Technologieplattform dar, die den gleichzeitigen Nachweis von Einzelpunktmutationen und Änderungen im Genexpressionsmuster in einem Hochdurchsatzverfahren erlaubt. Aus Sicht der Tumordiagnostik und -therapie ist ein ultimatives Ziel, aus der umfassenden Genanalyse für den Patienten eine Risikoabschätzung durchzuführen und einen maßgeschneiderten Therapieplan zu entwickeln. Derzeit bedarf dies jeweils einer getrennten Chipentwicklung. Die Herausforderung bei der Entwicklung dieser neuen Technologieplattform galt dem Auffinden einer geeigneten, regulierbaren Oberflächenchemie zur Herstellung der Arrays. Zudem spielte die Etablierung eines geeigneten biologischen Amplifikationsverfahrens zur Anwendung auf dem Biochip, welches den diagnostischen Anforderungen wie Spezifität, Sensitivität und Robustheit stand hält, eine zentrale Rolle. In der ersten Hälfte des Bewilligungszeitraums konnte die Funktionalität der zu entwickelnden Chipplattform aus Kunststoffchips bedruckt mit Microarrays bestehend aus oberflächengebundenem Hydrogel eindeutig gezeigt werden. Anhand zweier Genexpressionsparameter und zwei Einzelpunktmutationen als Teil eines definierten genetischen Konzeptes zur Diagnostik des Mammakarzinoms wurde ein isothermes Verfahren, die NASBA-on-chip („Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) unter Verwendung realer Gewebeproben entwickelt. Mit Hilfe von stem-loop- Primern konnte die Analyse von Genexpressionsregulatoren, den miRNAs in diesen Prozess eingebunden werden. Durch Einführung nicht-humaner Sequenzen in die Primersequenzen konnte die sogenannte universelle NASBA entwickelt werden. Diese ermöglicht simultan die Analyse der Genexpression, der micRNAs und mittels dem Prozess nachgelagerte Erfassung der Schmelzkurven nach onchip Hybridisierung die Analyse der Einzelpunktmutationen. Die Echtzeit-Detektion der Amplifikation on-chip konnte wider Erwarten nicht mit direkt markierten Analyten durchgeführt werden, da trotz TIRF-Anregung das Hintergrundsignal zu hoch war. Daher wurden spezielle Sonden („Molecular Beacons“) immobilisiert und mithilfe dieser Molecular Beacon Array ein "proof of concept" zur Echtzeit-Detektion erarbeitet.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Alternative splicing of Cyr61 is regulated by hypoxia and significantly changed in breast cancer. Cancer Res. 2009 Mar 1;69(5):2082-90
Hirschfeld M., zur Hausen A., Bettendorf H., Jäger M. und Stickeler E.
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Performance of a polymer-based DNA chip platform in detection and genotyping of human papillomavirus in clinical samples. J Clin Microbiol.; 2009, 47(5):1428-35
Schenk T., Brandstetter T., zur Hausen A., Alt-Mörbe J., Huzly D. und Rühe J.
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Proliferation is the strongest prognosticator in node-negative breast cancer: significance, error sources, alternatives and comparison with molecular prognostic markers. Breast Cancer Res Treat. 2009 May;115(2):241-54
Baak J.P., Gudlaugsson E., Skaland I., Guo L.H., Klos J., Lende T.H., Søiland H., Janssen E.A. und zur Hausen A.
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A Polymer-based DNA Biochip Platform for Human Papilloma Virus Genotyping. J Virol Methods. 2010 Jan;163(1):40-8
Brandstetter T., Böhmer S., Prucker O., Bissé E., zur Hausen A., Alt-Mörbe J. und Rühe J.
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Microarray-based Amplification and Detection of RNA by Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA). Analytical Bioanalytical Chemistry 2010, 397(8):3533-41
Mader A., Riehle U., Brandstetter T., Stickeler E., zur Hausen A. und Rühe J.
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Nucleic acid sequence-based amplification in formalin-fixed and paraffin-embedded breast-cancer tissues. J Clin Pathol. 2010 (63)12: 1071-6
Riehle U., Mader A., Brandstetter T., Rühe J., zur Hausen A. und Stickeler E.
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Prospective multicenter comparison of proliferation and other prognostic factors in lymph node negative lobular invasive breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2010 May;121(1):35-40
Gudlaugsson E., Skaland I., Janssen E.A., van Diest P.J., Voorhorst F.J., Kjellevold K., zur Hausen A. und Baak J.P.
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Protein Microarrays on Plastic Substrates. Analytica chimica acta 2010, 671, 92-98
Moschallski M., Baader J., Prucker O. und Rühe J.
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Temperature and time resolved TIRF analysis of reusable DNA hydrogel chips. Analytical Chemistry, Vol. 82, No. 14, July 15, 2010, 6124-6134
Neumann T., Bonham A. J., Dame G., Bertold B., Brandstetter T. und Rühe J.
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A Simple One-Step Procedure for Immobilization of Biomolecules on Plastic Surfaces using Surface-Attached Polymer Networks. Langmuir, 2011, 27 (10), pp 6116–6123
Rendl M., Bönisch A., Mader A., Schuh K., Prucker O., Brandstetter T. und Rühe J.
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Universal nucleic acid sequence-based amplification for simultaneous amplification of messengerRNAs and microRNAs, Analytica Chimica Acta 754 (2012) 1–7
Mader A., Riehle U., Brandstetter T., Stickeler E. und Rühe J.
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Sensitivity of Microarray-Based Immunoassays on Plastic Substrates. Analytica Chimica Acta, 2013, 781, 72-79
Moschallski M., Evers A., Brandstetter T. und Rühe J.
