Interdisziplinäre Analyse pilzlicher Rhodopsine und ihrer physiologischen Funktion in Myzelien.

• Antragsteller: Dr. Ulrich Terpitz
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 251151058

Viele essentielle Prozesse in filamentösen Pilzen werden durch Licht gesteuert. Pilze besitzen von Natur aus verschiedene Lichtsensoren, die auf ein breites Spektrum von Wellenlängen reagieren können. Grünes Licht wird von pilzlichen Rhodopsinen rezipiert. Diese Membranproteine gehören zu den mikrobiellen Rhodopsinen, die in den letzten Jahren aufgrund ihrer Verwendung in der Optogenetik an Bedeutung gewonnen haben. Pilzliche Rhodopsine bestehen aus sieben Transmembranhelizes und enthalten das Chromophor Retinal, das mit dem Protein kovalent durch eine protonierte Schiff-Base verbunden ist. Obwohl bekannt ist, dass pilzliche Rhodopsine als lichtabhängige Protonenpumpen oder sensorische Proteine fungieren, fehlt bisher ein detailliertes Verständnis der physiologischen Funktion und biologischen Rolle. In diesem Projekt werden wir die molekulare Funktion und biologische Rolle ausgewählter pilzlicher Rhodopsine analysieren. Wir werden eine Reihe biophysikalischer Methoden kombinieren, um die molekulare Funktionsweise von Rhodopsinen aus den filamentösen Pilzen Neurospora crassa (Nop-1), Fusarium fujikuroi (CarO, OpsA), Phaeosphaeria nodorum (PhaeoRD1, PhaeoRD2), Leptosphaeria maculans (LR) und Ustilago maydis (UmOps1-3) zu charakterisieren. Wir werden pilzliche Rhodopsine heterolog in Säugerzellen oder Hefen exprimieren und mit der Patch-clamp-Technik analysieren. Dabei werden wir uns auf die Art der transportierten Ionen, die Pumpkinetiken, die Spannungsabhängigkeit, die Ionendurchsatzrate und auch auf die Eignung in optogenetischen Anwendungen konzentrieren. Darüber hinaus werden wir einige pilzliche Rhodopsine isolieren und Intermediate des Fotozyklus mittels Blitzlicht-Photolyse-Spektroskopie analysieren. Um erste Einblicke in die biologische Rolle pilzlicher Rhodopsine zu erlangen, werden wir fluoreszierende Rhodopsine in Hyphen von N. crassa, F. fujikuroi und U. maydis exprimieren und fixierte, mit Immunfluoreszenz gefärbte Myzelien mit konfokaler (cLSM) und superaufgelöster Lokalisations-Mikroskopie (PALM/ dSTORM) eingehend untersuchen. Wir werden pH-sensitive Farbstoffe in lebenden F. fujikuroi Hyphen verwenden, um lokale pH-Veränderungen nach Aktivierung pilzlicher Rhodopsine zu beobachten. Um mögliche biologische Funktionen pilzlicher Rhodopsinen herauszufinden, werden wir darüber hinaus die Wachstumsparameter verschiedener F. fujikuroi Stämme (WT und Deletionsmutanten Rhodopsine/Lichtrezeptoren), die bei unterschiedlichen Licht- und Nährstoffbedingungen kultiviert wurden, miteinander vergleichen. Pilzinfektionen nehmen aufgrund des Klimawandels und der intensiven Landwirtschaft zu. Daher ist es sehr wichtig, detailliertes Wissen darüber zu erlangen, wie Pilze auf ihre Umwelt, insbesondere auf Licht, reagieren. Die Ergebnisse dieses Projektes können in langfristiger Perspektive dazu beitragen, die Entwicklung dringend benötigter Fungizide zu unterstützen und/oder Wachstum von Pilzen in biotechnologische Applikationen zu verbessern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen