Ein gezähmtes Killerenzym: Detaillierte Analyse der Roseoflavin-spezifischen Phosphatase RosC aus Streptomyces davaonensis

• Antragsteller: Professor Dr. Matthias Mack
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 251267597

Streptomyces davaonensis und Streptomyces cinnabarinus sind die einzigen bekannten Bakterienarten, die das Antibiotikum Roseoflavin synthetisieren. Daher sind diese Organismen auch die einzigen, die die Enzyme der Roseoflavinbiosynthese und insbesondere der Roseoflavin-spezifischen Phosphatase RosC besitzen. Genexpressions- und Gendeletionsexperimente, die im Verlauf vom vorhergegangen Projekt durchgeführt wurden, führten zur Entdeckung des letzten noch unbekannten Enzyms der Roseoflavinbiosynthese. In Kooperation mit Ulrich Ermler (Max-Planck-Institut für Biophysik, Frankfurt) konnte die Kristallstruktur des neuartigen Proteins gelöst werden (bis 1.6 Å). Durch diese Arbeiten und durch ortsspezifische Mutagenese konnten wir die Aminosäuren im aktiven Zentrum identifizieren, die sehr wahrscheinlich bei der Katalyse und Substraterkennung eine wichtige Rolle spielen. Wir wollen jetzt im Fortsetzungsantrag zusätzliche Mutanten erzeugen und vor allem auch die wichtigen aber bisher noch nicht durchgeführten kinetischen Analysen nachholen. RosC hat im Gegensatz zu allen anderen Mitgliedern der Histidinphosphatasen einen N-Terminus, der aus 22 Aminosäuren besteht. Diese 22 AS bilden eine alpha-Helix, die wie ein „Deckel“ am Aufbau des aktiven Zentrums von RosC und der Bindung der Substrate beteiligt ist. Dieser Aspekt soll ebenfalls im vorliegenden Antrag untersucht werden. FMN ist ein wichtiger Kofaktor und wird in S. davaonensis von der bifunktionellen Flavokinase/FAD-Synthetase RibCF (die ebenfalls in der AG Mack identifiziert wurde) gebildet. Wir haben herausgefunden, dass RosC neben AFP auch FMN dephosphoryliert. Die gleichzeitige Bildung der Roseoflavinvorstufe FMN durch RibCF und eine daran anschließende Dephosphorylierung durch RosC hat das Potential einen „vergeblichen Zyklus“ (futile cycle) zu bewirken. Aus diesem Grund wollen wir verstehen welche Aminosäuren in RosC an der Unterscheidung zwischen AFP und FMN beteiligt sind. Unsere Strukturdaten deuten auf D166 und aus diesem Grund konzentrieren wir uns bei unseren geplanten Analysen zunächst auf diesen Aminosäurerest. Unsere im Vorfeld durchgeführten Mutageneseexperimente zeigen, dass die Bildung der RosC Mutanten D166L, D166V und D166I in E. coli zu einem Wachstumsstopp führen. Unsere in vitro Daten zeigen eindeutig, dass weder FMN noch Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) von den RosC Mutanten dephosphoryliert wird. Wir vermuten, dass ein anderer wichtiger zellulärer Phosphometabolit (oder auch mehrere) von diesen RosC Mutanten dephosphoryliert wird. Der Antrag hat neben den oben beschriebenen Zielen das Ziel diesen Phosphometaboliten zu identifizieren. Möglicherweise entdecken wir dabei eine noch unbekannte Zielstruktur für antibakterielle Wirkstoffe in Bakterien.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen