Weiterentwicklung massenspektrometrischer Detektionsverfahren zur Analyse von Neurotransmittern/Neuromodulatoren aus identifizierbaren Neuronen der Taufliege Drosophila melanogaster
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Ziel des Projektes war es eine Methodik zu etablieren, um aus einzelnen, neuroanatomisch charakterisierten Zellkörpern der Taufliege, Drosophila melanogaster biogenen Aminen biochemisch zu charakterisieren und zu quantifizieren. Dabei lag der Fokus auf den biogene Aminen Oktopamin (OA), Thyramin (TA) und Dopamine (DA) und dem Neurotransmitter Acethylcholin. Die Analysen der Moleküle sollte über das massenspektrometrische Verfahren der Matrix-unterstützenden Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS; matrix-assisted laser/desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) und eines Kopplungsverfahren aus Kapillarelektrophorese (CE, capillary electrophoresis) und Massenspektrometrie (MS) erfolgen. Letzteres musste auf Grund von anhaltenden Problemen an der Hardware des Massenspektrometers noch im ersten Jahr verworfen werden. Somit konzentrierte sich das Projekt auf die Etablierung eines Verfahrens zur qualitativen und quantitativen MALDI-TOF massenspektrometrische Einzelzellmessung kleiner Neurotransmitter und potentieller Neuropeptide (=Neuropeptidom). Ziel war es erstmals Colocalisationen beider Signalmolekülklassen (klassische Neurotransmitter und Neuropeptide) in neuroanatomisch charakterisierte Neuronen biochemisch nachzuweisen. Der präparatorische und massenspektrometrische Ansatz um das Peptidom einzelner Drosophila Zellen zu analysieren, war bereits etabliert (Neupert et. al. 2007), so dass der Fokus im ersten Schritt auf der Etablierung eines massenspektrometrischen Ansatz für eine stabile und reproduzierbare Messung klassischer Neurotransmitter lag. Dabei wurde das limit of detection (LOD) mit Hilfe von synthetischen Substanzen (OA, TA, DA, Ach) in unterschiedlichen Konzentrationen bestimmt. Zur Stabilisierung der Moleküle während der Messungen wurden verschiedene Substanzen zur Derivatisierung der Moleküle getestet. Anschließend wurde die Zugabe iosotopisch markierten Standards bekannter Konzentrationen getestet, um reproduzierbare und stabile Quantifizierungsmessungen zu gewährleisten und das Lower limit of Quantification (LLOQ) zu bestimmen. In der zweiten Phase des Projektes wurde OA und TA von einzelnen Drosophila Zelle unterschiedlicher Zellpopulationen beider Geschlechter bestimmt, verglichen und deren Konzentrationsänderungen nach Verhaltensexperimenten (Aggressionsverhalten) untersucht. Eine stabile, schnelle und reproduzierbare Einzelzellpräparationstechnik wurde dafür optimiert. Des Weiteren wurde der Einfluss von Temperatur und Licht auf die Reproduzierbarkeit der MS-basierten Einzelzellmessungen evaluiert. Zusätzlich wurde der Nachweis erbracht, dass die masseidentischen Transmitter OA und DA eindeutig unterschieden werden können. Auch konnte der präparatorische und analytische Ansatz zur Bestimmung von OA und TA identifizierter Insektenneurone in ein Kooperationsprojekt mit Dr. Joachim Schmitt (Universität Köln) eingebracht werden. Auf Grund der Molekülstruktur von Ach ist es nicht notwendig dieses vor der AMLDI-TOF MS Analyse zu derivatisieren. Der Nachweis von Ach aus einzelnen identifizierten Krebsneuronen erfolgte in Kooperation mit Dr. Carmen Wellmann (Universität zu Köln). Das dritte Teilprojekt fokusierte sich auf die Kartierung des Neuropeptidom einzelner neuroanatomische charakterisierter Zellkörper der adulten Fruchtfliege.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
-
(2018) Neuropeptide mapping of DIMM dimmed cells of adult Drosophila brain. JASMS. 29:890-902
Diesner M, Predel R, Neupert, S
-
(2018) Profiling neurotransmitters in a crustacean neural circuit for locomotion. PLOS One. 13(5):e0197781
Schneider AC, Seichter H, Neupert S, Hochhaus AM, Smarandache-Wellmann CR
-
(2018) Quantification of biogenic amines from individual GFP-labelled Drosophila cells by direct MALDI-TOF mass spectrometry. Anal. Chem. 90:8035-8043
Diesner M, Neupert S
-
(2019) Descending octopaminergic neurons modulate sensory-evoked activity of thoracic motor neurons in stick insects. J Neurophysiol. 122:2388-2413
Stolz T, Diesner M, Neupert S, Hess ME, Delgado-Betancourt E, Pflüger HJ, Schmidt J
