Aufrechtes spektrales filterfreies konfokales Laser-Scanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Das konfokale Mikroskop mit Weißlichtlaser bietet eine Vielzahl von spezifischen Anregungswellenlängen, die für die Darstellung von einzelnen fluoreszenz-markierten Neuronen mittels des „Flybow“ Systems essentiell sind. Hierbei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem verschiedene in das Drosophila Genom integrierte Fluoreszenzprotein-kodierende cDNA Kassetten (z.B. cd8-EGFP, cd8-mCherry, mp-mCitrine, mp-mTq) durch ein Hitze-induzierbares Flp-FRT-Mosaiksystem zufällig ausgeschnitten werden können. Als Folge werden einzelne Zellen in unterschiedlichen Farbnuancen dargestellt und können in voller Länge sichtbar gemacht und von anderen unterschieden werden. Wir haben dieses System genutzt, um individuelle Neuronen im circadianen Uhrnetzwerk zu markieren und ihre Rolle im gesamten Netzwerk näher aufzuklären. Des Weiteren haben wir mit dem „Flybow“ System peptiderge Neurone auf Einzelzellebene dargestellt, die für das Schlüpfen der Fliege aus der Puppe relevant sind. Die freie Kombinierbarkeit aller Laserwellenlängen war außerdem extrem wichtig zur optimalen Anregung von Mehrfach-Fluoreszenzen und der Reduktion des „Crosstalks“ zwischen verschiedenen Kanälen bei der Darstellung des circadianen Uhrnetzwerkes der Honigbiene, von Ameisen der Gattung Camponotus, der Olivenfliege Bactrocera oleae sowie verschiedener Drosophila-Arten. Auch zur Charakterisierung der Nähe verschiedener peptiderger Neuronen im Gehirn von Drosophila melanogaster, die in die Regulation von Schlaf, Nahrungsaufnahme und das Timing des Schlüpfens aus der Puppe involviert sind, wurde und wird das konfokale Mikroskop eingesetzt. Die Möglichkeit Fluoreszenzen zu quantifizieren wurde genutzt, um die relative Menge des Uhrproteins „Period“ zu verschiedenen Zeitpunkten sowie um den CREB-Spiegel in spezifischen Uhr-Neuronen zu bestimmen. Die gleiche Methode wurde und wird für die Quantifizierung des Uhrproteins PDP1 (Par Domain Protein 1) bei Fliegenarten wie Chymomyza costata und Drosophila ezoana genutzt, bei denen der Antikörper gegen „Period“ nicht bindet. Die Möglichkeit Autofluoreszenzen fast vollständig auszublenden, war extrem hilfreich bei der Lokalisierung von Rhodopsinen und des Blaulichtpigments Cryptochrom in den Komplexaugen der Fliege, in denen das rote Augenpigment eine starke Autofluoreszenz zeigt. Optimal war das Konfokale Mikroskop auch für die Detektion von „GRASP“-Signalen (GFP „Reconstitution Across Synaptic Partners“) zwischen Photorezeptorzellen und circadianen Uhr-Neuronen, zwischen Uhr-Neuronen und Kenyonzellen der Pilzkörper sowie zwischen dopaminergen Neuronen und circadianen Uhr-Neuronen. Zur subzellulären Lokalisation der Kinase RSK und des Peptids PDF in spezifischen Uhr-Neuronen war die optimale Trennung der beiden Anregungen und die hohe Flankensteilheit der des filterfreien Systems von großem Vorteil. Die Möglichkeit konfokale Aufnahmen mit Durchlichtaufnahmen zu kombinieren wird zurzeit extensiv in einem Projekt von Dr. Selcho genutzt, in dem sie es sich zum Ziel gesetzt hat, eine detaillierte anatomische Karte des oktopaminergen /tyraminergen Systems der gesamten Fliege zu erstellen (gefördert durch die German Excellence Initiative to the Graduate School of Life Sciences, University of Würzburg; PostDocPlus Funding).
Publications
- (2016) A neuronal network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity. J Neurosci 36(35), 9084-9096
Schlichting M, Menegazzi P, Lelito K, Yao Z, Buhl E, Dalla Benetta E, Bahle A, Denike J, Hodge JJL, Helfrich-Förster C, Shafer OT
(See online at https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0992-16.2016) - (2016) Allatostatin A signalling in Drosophila regulates feeding and sleep and is modulated by PDF. PLoS Genetics 12(9):e1006346
Chen J, Reiher W, Hermann-Luibl C, Sellami A, Cognigni P, Kondo S, Helfrich-Förster C, Veenstra JA, Wegener C
(See online at https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006346) - (2016) The timed depolarization of morning and evening oscillators phase shifts the circadian clock of Drosophila. J Biol Rhythms 31(5), 428-442
Eck S, Helfrich-Förster C, Rieger D
- (2017) A new Rhodopsin influences lightdependent daily activity patterns of fruit flies. J Biol Rhythms 32, 406-422
Kistenpfennig C, Grebler R, Ogueta M, Hermann-Luibl C, Schlichting M, Stanewsky R, Senthilan PR, Helfrich- Förster C
(See online at https://doi.org/10.1177/0748730417721826) - (2017) Adaptation of circadian neuronal network to photoperiod in high-latitude European Drosophilids. Curr Biol 27, 833-839
Menegazzi P, Dalla Benetta E, Beauchamp M, Schlichting M, Steffan-Dewenter I, Helfrich-Förster C
(See online at https://doi.org/10.1016/j.cub.2017.01.036) - (2017) Central and peripheral clocks are coupled by a neuropeptide pathway in Drosophila, Nature Comm 8, 15563
Selcho M, Millán C, Palacios-Muñoz A, Ruf F, Ubillo L, Chen J, Bergmann G, Ito C, Silva V, Wegener C, Ewer E
(See online at https://doi.org/10.1038/ncomms15563) - (2018) Anatomical characterization of PDF-Tri neurons and peptidergic neurons associated with eclosion behavior in Drosophila. J Comp Neurol
Selcho M, Mühlbauer B, Hensgen R, Shiga S, Christian Wegener C, Yasuyama K
(See online at https://doi.org/10.1002/cne.24408) - (2018) Neuroanatomical details of Drosophila lateral neurons support their functional role in the circadian system. J Comp Neurol
Schubert FK, Hagedorn N, Yoshii T, Helfrich-Förster C, Rieger D
(See online at https://doi.org/10.1002/cne.24406) - (2018) Pigment-Dispersing Factor expressing neurons provide an infrastructure for conveying circadian information in the honey bee brain. Open Biology 8, 170224
Beer K, Kolbe E, Kahana N, Yayon N, Weiss R, Menegazzi P, Bloch G, Helfrich-Förster C
(See online at https://doi.org/10.1098/rsob.170224) - (2018) The olive fly, Bactrocera oleae, has a Drosophila-like clock. Sci Reports 8, 816
Bertolini E, Kistenpfennig C, Menegazzi P, Koukidou M, Helfrich-Förster C
(See online at https://doi.org/10.1038/s41598-018-19255-8)
