Konfokales Laser Scanning Mikroskop
Final Report Abstract
Das Gerät wurde bisher sehr erfolgreich für eine Vielzahl von Forschungsprojekten eingesetzt und konnte so zum erfolgreichen Abschluss dieser Projekte inklusive Publikationen, verschiedensten Abschlussarbeiten und ebenfalls der Initiierung neuer Forschungsprojekte beitragen. Der Haupteinsatzbereich des Geräts lag auf Forschungsthemen bezüglich der Nachbildung von dreidimensionalen (3D) extrazellulären Matrices (ECM) für in vitro Zellkulturanwendungen. Dabei konnten auf Basis des im Menschen am häufigsten vorkommenden Proteins der ECM, Kollagen I, definierte fibrilläre 3D Netzwerke hergestellt werden. Durch kontrollierte Variation der Fibrillierungsbedingungen (Puffer (Salz-, Phosphatkonzentration, pH), Kollagenkonzentration) konnte die Fibrillierungskinetik und damit die Netzwerkmikrostruktur (Fibrillendurchmesser, Porengröße) eingestellt werden, womit ECM-Zustände wie in in vivo Geweben nachgebildet wurden. Zudem konnte in einem nachfolgenden Prozessschritt bei gleichbleibender Netzwerkstruktur biophysikalische und biochemische Modifikationen wie Vernetzung und Erhöhung der Steifigkeit, Anbindung von Glykosaminoglykanen mit unterschiedlicher Sulfatierung (Hyaluronsäure, Heparin) und Kopplung von adhäsionsvermittelnden Glykoproteinen erreicht werden. Zudem wurden Grenzflächen unterschiedlicher Netzwerkstrukturen als Nachbildung von Gewebegrenzen etabliert. Bei diesen Arbeiten konnte mit Hilfe des Geräts eine quantitative Analyse der 3D Netzwerkmikrostruktur (unterstützt durch selbstentwickelte Bildanalysealgorithmen) sowie der homogenen und stabilen Funktionalisierungen mittels Fluoreszenzmarkierung nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde ein Mikropartikel-basiertes Langzeit-Freigabesystem etabliert, welches es erlaubt, lokale biomimetische Gradienten von Zytokinen in 3D Matrices über mehrere Tage aufrechtzuhalten. Der quantitative Nachweis der Funktionalisierung der Mikropartikel, deren Zytokinfreigabe über mehrere Tage sowie der Ausbildung von lokalen Zytokingradienten um die Mikropartikel wurde mit Hilfe des Geräts erreicht. In in vitro Zellkulturexperimenten konnte die Funktionalität der neu entwickelten biomimetischen 3D Matrices erfolgreich gezeigt werden, wobei Themenfelder wie Fibroblastendifferenzierung und Makrophagenpolarisierung bei der dermalen Wundheilung, Chemotaxis von Blutstammzellen und Proliferation und Invasion von Brustkrebs- und Melanomzellen adressiert wurden. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass eine langsame und kontinuierliche lokale Freigabe von TGF-beta1 in den 3D Systemen zu einer Myofibroblastendifferenzierung von dermalen Fibroblasten bei deutlich geringeren Konzentrationen (2 Größenordnungen) als in klassischen Zellkultursystemen und damit eher der in vivo Situation entspricht. Auch konnte bei der Invasion von Brustkrebszellen an nachgebildeten Gewebegrenzen eine Änderung des migratorischen Phänotyps zu gerichteter, hochinvasiver Migration nur in Abhängigkeit der Änderung der Porengröße der 3D Matrix von kleinen zu großen Poren gefunden werden. Die dazugehörigen detaillierten immunfluoreszenzbasierten Zelluntersuchungen in den 3D Matrices wurden in großem Umfang an dem Gerät durchgeführt. Zudem wurde das Gerät bei Untersuchungen zur biochemischen Modifizierung von Hydrogelpartikeln genutzt, welche für Biosensoranwendungen u.a. zum Nachweis von Pestizidrückständen im Wasser aber auch für Adhäsionsuntersuchungen an Zellen wie z.B. beim Rezeptor-Ligand-System CD44-Hyaluronsäure eingesetzt werden. Dabei konnten über Fluoreszenzmarkierungen die homogene 3D Modifizierung der Mikropartikel sowie der quantitative Funktionalisierungsgrad nachgewiesen werden. In der Pharmazeutischen Technologie wurde das Gerät zur Charakterisierung der Aufnahme von fluoreszenzmarkierten siRNA Nanopartikeln in primäre Stammzellen aus dem Fettgewebe und Zelllinien einsetzt. Ziel war es, die Abhängigkeit vom komplexierenden Transfektionsreagenz und dem eingesetzten Controlled Release System zu untersuchen. Insgesamt hat das Gerät damit bisher seine Erwartungen vollkommen erfüllt. Es konnte in einem breiten Untersuchungsspektrum von Mikrostrukturanalysen an Biopolymernetzwerken, des dynamischen Freigabeund Transportverhaltens von Zytokinen aus Mikropartikeln sowie von in vitro Zellexperimenten zum Thema Wundheilung, Regeneration und Tumorinvasion genutzt werden.
Publications
- Glycosaminoglycan functionalization of mechanically and topologically defined collagen I matrices. J Materials Chemistry B 3:8902-10 (2015)
Kalbitzer L, Franke F, Möller S, Schnabelrauch M, Pompe T
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Sapudom J, Rubner S, Martin S, Thoenes S, Anderegg U, Pompe T
(See online at https://doi.org/10.1039/c5bm00140d) - The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials 52:367-75 (2015)
Sapudom J, Rubner S, Martin S, Kurth T, Riedel S, Mierke CT, Pompe T
(See online at https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.02.022) - Mimicking Tissue Boundaries by Sharp Multiparameter Matrix Interfaces. Adv Healthc Mater 5:1861-7 (2016)
Sapudom J, Rubner S, Martin S, Pompe T
(See online at https://doi.org/10.1002/adhm.201600295) - Short-range cytokine gradients to mimic paracrine cell interactions in vitro. J Control Release 224:59-68 (2016)
Ansorge M, Rastig N, Steinborn R, Konig T, Baumann L, Moller S, Schnabelrauch M, Cross M, Werner C, Beck-Sickinger AG, Pompe T
(See online at https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2015.12.053) - Fibroblast fate regulation by time dependent TGF-beta1 and IL-10 stimulation in biomimetic 3D matrices. Biomater Sci 5:1858-67 (2017)
Sapudom J, Wu X, Chkolnikov M, Ansorge M, Anderegg U, Pompe T
(See online at https://doi.org/10.1039/c7bm00286f) - Instructing Human Macrophage Polarization by Stiffness and Glycosaminoglycan Functionalization in 3D Collagen Networks. Adv Healthc Mater 6:1600967 (2017)
Friedemann M, Kalbitzer L, Franz S, Moeller S, Schnabelrauch M, Simon JC, Pompe T, Franke K
(See online at https://doi.org/10.1002/adhm.201600967) - Mimicking Paracrine TGFbeta1 Signals during Myofibroblast Differentiation in 3D Collagen Networks. Sci Rep 7:5664 (2017)
Ansorge M, Sapudom J, Chkolnikov M, Wilde M, Anderegg U, Moller S, Schnabelrauch M, Pompe T
(See online at https://doi.org/10.1038/s41598-017-05912-x) - Molecular weight specific impact of soluble and immobilized hyaluronan on CD44 expressing melanoma cells in 3D collagen matrices. Acta Biomater 50:259-70 (2017)
Sapudom J, Ullm F, Martin S, Kalbitzer L, Naab J, Moller S, Schnabelrauch M, Anderegg U, Schmidt S, Pompe T
(See online at https://doi.org/10.1016/j.actbio.2016.12.026) - Fibril growth kinetics link buffer conditions and topology of 3D collagen I networks Acta Biomaterialia (2018)
Kalbitzer L, Pompe T
