The Barcoding project: development of mass sequencing workflows.
Final Report Abstract
Die wichtigste Komponente von Biodiversität sind die Arten. Veränderungen der biologischen Umwelt drücken sich in Änderungen von Abundanz und Präsenz von spezifischen Arten aus. Die wiederholte Bestandsaufnahme und Identifikation von Arten zur Detektion von Trends oder zur Analyse der Effekte von Freilandexperimenten ist für eine größere Anzahl von Taxa mit herkömmlichen Methoden nicht möglich. Diese sind zeitaufwändig und beanspruchen häufig die Expertise gleich mehrerer Taxonomen. Zudem ist der Zugang zu dieser Art von Fachwissen und damit auch die Auswertung von Daten limitiert. Ob dieser Engpass mit Analysen von Massenproben mit Hilfe von DNA-Barcoding zu überwinden ist, sollte in diesem Projekt am Beispiel sehr artenreicher Insektengruppen überprüft werden. Der ursprüngliche Fokus lag dabei auf der Gruppe der Dipteren (Mücken & Fliegen), einem Taxon, das ubiquitär anzutreffen und reich an Arten ist. Die Verwendung von DNA-Barcoding als Werkzeug umfasste dabei mehrere Aspekte, die es zu erfüllen galt: i) die Etablierung einer DNA Barcode Datenbank für deutsche Dipteren, mit einem besonderen Schwerpunkt auf den in den Exploratorien vertretenen Taxa, ii) die Arbeit mit MOTUs (molecular taxonomic units), wenn die Taxonomie der Arten nicht bestimmt werden konnte und der Linnésche Name nicht zur Verfügung steht, iii) einen auf diese Aufgabe ausgerichteten Arbeitsfluss zu etablieren, und iv) die Anwendbarkeit von Massensequenzierungen auf Grundlage der "second-generation sequencing" Technologie zu überprüfen. Bei den Versuchen sollte auch die Anwendung für ökologische Fragestellungen, wie die Bestimmung von alpha- und beta-Diversität im Vergleich von bewirtschafteten und unbewirtschafteten Waldflächen, berücksichtigt werden. Im Rahmen von Pionierarbeit im Labor des Museums Koenig (Bonn) zeigte es sich, dass durch die Anwendung neuster Methoden der DNA Aufbereitung (Target Enrichment) und unter strikter Einhaltung der Qualitätsansprüche an das zu verarbeitende Material die Ziele werden können. Datensätze von größerem Umfangs als bisher sind präzise zu bearbeiten. Die Identifizierung von Arten bedarf keiner bestimmten taxonomischen Expertise, sondern misst sich allein am Umfang und Qualität der zum Vergleich herangezogenen Datenbank. Und auch ohne Linnésche Klassifizierungen sind Vergleiche zwischen den Proben und ökologische Fragestellungen nach alpha- und beta-Diversität durch die Verwendung von MOTUs (molecular taxonomic units) möglich. Der in dieser Arbeit etablierte Workflow beginnt bereits bei der Probenentnahme, erstreckt sich über die Probenverarbeitung, bis zur Auswertung und kann dabei, wenn nötig, von einer einzelnen Person durchgeführt werden. Hierfür wurde zusätzlich zu Laborroutinen und Softwareverarbeitung eine automatisierter Probensammler entwickelt, welcher paralleles Beproben an mehreren Standorten ermöglicht und dabei die Qualität der Proben sichert. Ein wesentliches Ergebnis sind die methodischen Erfahrungen und die Anleitungen für Arbeitsabläufe, die sich bewährt haben, sowie die Entwicklung eines automatischen Probensammlers, der künftig den Arbeitsaufwand erheblich reduzieren wird. Die Etablierung von Routine-Arbeitsabläufen für Massenproben ist aufwändiger als zunächst vermutet, es zeichnet sich aber ab, dass nur so die großen Probenmengen, die in ökologischen Projekten anfallen, bewältigt werden können.
Publications
-
(2016) Searching for the Optimal Sampling Solution: Variation in Invertebrate Communities, Sample Condition and DNA Quality. PLoS ONE 11(2): e0148247
Gossner M.M., Struwe J.F., Sturm S., Max S., McCutcheon M., Weisser W.W., Zytynska S.E.
