Charakterisierung, Expansion und Differenzierung von induzierten kardialen Progenitorzellen (iCPCs)

• Antragsteller: Professor Dr. Markus Krane
• Fachliche Zuordnung: Herz- und Gefäßchirurgie
• Förderung: Förderung seit 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 253102510

Die direkte Reprogrammierung von ortsständigen Fibroblasten hin zu mesodermalen oder kardialen Progenitorzellen stellt einen der aktuell vielversprechendsten regenerativen Therapieansätze dar. In unseren Vorarbeiten konnten wir einen Gen-Cocktail von mindestens 4 Faktoren identifizieren der reproduzierbar zu einer Induktion von Progenitorzellen (iCPCs) führt. Für die Identifikation des geeigneten Gen-Cocktails wurden transgene Fibroblasten verwendet, die YFP unter der Kontrolle eines Nkx2.5 cardiac enhancers exprimieren. Die generierten iCPCs sind YFP positiv, zeigen ein kolonieartiges Wachstum und weisen ein mesodermales Expressionsprofil (z.B. Eomes, Ets2) auf. Gleichzeitig werden typische Fibroblastenmarker abgeschaltet. In dem beantragten Projekt sollen die generierten iCPCs näher charakterisiert, ihre Expansion erreicht und eine effiziente Differenzierung zu terminal differenzierten kardialen Zelltypen vorgenommen werden.Im ersten Zielabschnitt werden die iCPCs auf Einzelzellebene (Single-Cell RNASeq) im Detail untersucht. Wir gehen davon aus, ähnlich wie bei der Generierung von iPS Zellen, dass sich die iCPCs in unterschiedlichen Stadien der Transdifferenzierung befinden. Dementsprechend soll Single-Cell RNASeq Aufschlüsse über die Heterogenität der generierten iCPCs liefern. Des Weiteren werden die generierten iCPCs zu unterschiedlichen Vorläuferzellen verschiedener Stadien der Herzentwicklung (z.B. primitive streak oder mesodermale Progenitorzellen) verglichen. Dies soll dazu dienen das entwicklungsbiologische Stadium der iCPCs besser einordnen zu können.Im zweiten Zielabschnitt werden epigenetische Untersuchungen an den iCPCs durchgeführt. Durch eine vergleichende Untersuchung zwischen Progenitorzellen aus transgenen in-vivo Modellen und den iCPCs sollen Unterschiede bezüglich der Histonmodifikationen und des globalen Methylierungsstatus herausgearbeitet werden. In Zielabschnitt drei wird die Optimierung geeigneter Kultur- und Expansionsbedingungen der iCPCs unter Erhaltung ihres spezifischen Phänotyps vorgenommen. Um zunächst Hinweise darauf zu erhalten wie verschiedene Progenitorzellstadien, z.B. primitive streak- oder mesodermale Progenitorzellen, kultiviert werden müssen ohne weiter auszudifferenzieren, sollen iPS Linien von geeigneten transgenen Mäusen genutzt werden, aus denen die entsprechenden Stadien differenziert und über einen Reporter isoliert werden können. In Zielabschnitt vier werden geeignete Bedingungen für eine effiziente kardiovaskuläre Differenzierung der iCPCs etabliert. Idealerweise sollen Kardiomyozyten, Endothelzellen sowie glatte Muskelzellen aus den iCPCs erzeugt werden können. Im fünften Zielabschnitt soll die aktuell verwendete Reprogrammierungsmethode an eine nicht integrativen Methodik adaptiert werden. Dazu werden Sendaiviren, wie sie heute routninemäßig bei der Herstellung von iPS verwendet werden, eingesetzt. Dies wäre ein erster translationaler Schritt hin zu einer möglichen Anwendung in vivo.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich(e): Dr. Stefanie Doppler