DNA-Reparatur und DNA-Schadensantwort zur Aufrechterhaltung der Endothelzellfunktion bei gentoxischem Stress
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Wir berichten über die Ergebnisse einer 3-Jahresförderung eines Kooperationsprojektes (Kaina/Fritz). In einem der Teilprojekte (AG Kaina) wurde der Einfluss der Expression des WRN-Proteins auf die Sensitivität von Endothelzellen gegenüber chemischen Genotoxinen, einschließlich Alkylantien und BPDE analysiert. Hierzu wurde die etablierte Zelllinie EA.hy926 und die diploide Telomerase-immortalisierte menschliche Fibroblasten-Linie VH10tert verwendet. Es zeigte sich, dass der Knockdown von WRN die Sensitivität (gemessen als Apoptoserate) beider Zellinien gegenüber BPDE erhöht, nicht aber gegenüber den Alkylanzien TMZ, CCNU und MMS. Wir schlussfolgern daraus, dass WRN in der Reparatur von BPDE-Addukten involviert ist. Die beobachtete Response gegenüber BPDE und die Bedeutung dieses polyzyklischen Kohlenwasserstoffs in der Karzinogenese (Nahrungs- und Umweltkarzinogen, Zigarettenrauch) veranlasste uns, die Wirkung von BPDE auf primäre menschliche Endothelzellen im Vergleich zu menschlichen Perizyten und glatten Muskelzellen, die zusammen das Endothelsystem bilden, zu untersuchen. Wir stellten fest, dass HUVEC signifikant empfindlicher auf BPDE reagieren als glatte Muskelzellen und Perizyten („Viability“, Apoptoseinduktion). Zudem weisen HUVEC nach BPDE-Behandlung eine erhöhte DNA-Strangbruchfrequenz auf und entfernen BPDE-Addukte (Post-labeling Experimente) nicht aus der DNA. Sie exprimieren ERCC1/XPF sowie Ligase I in geringerem Ausmaß als die anderen parallel untersuchten primären Zelltypen. Die Schlussfolgerung ist, dass primäre menschliche Endothelzellen eine Einschränkung in der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) aufweisen. Wir nehmen an, dass durch selektive Apoptose genetisch geschädigter Endothelzellen das Risiko zur malignen Endartung des Endothels minimiert wird. Da die genetische Erkrankung Werner Syndrom (WRN) mit einer vorzeitigen Alterung und frühen Sterblichkeit der Patienten aufgrund arteriosklerotischer Veränderungen einhergeht und Schädigung des Endothels für die Entstehung der Arteriosklerose bedeutsam ist, wurde in dem zweiten Teilprojekt (AG Fritz) untersucht, ob eine reduzierte Expression der WRN Helikase die Funktionalität nicht-proliferierender Endothelzellen in vitro beeinflusst. Hierzu wurde die Expression des WRN-Proteins mittels RNAi Transfektion in zwei verschiedenen endothelialen Modellsystemen (EA.hy926, immortalisierte humane Endothelzell-ähnliche Zelllinie; HUVEC, primäre humane Endothelzellen) herunterreguliert und prototypische endotheliale Funktionen in WRN profizienten versus WRN depletierten Zellen vergleichend überprüft. Die Resultate zeigen, dass das WRN Protein die Motilität endothelialer Zellen verbessert und somit vermutlich Regenerationsprozesse nach Endothelschädigung fördert. Des Weiteren hemmt WRN die Expression proinflammatorischer Faktoren (u.a. endothelialer Zelladhäsionsmoleküle) und wirkt somit vermutlich vaskulären Entzündungsvorgängen entgegen. Die Stabilität der Endothelzellbarriere und die Aufnahme von LDL werden durch WRN jedoch nicht beeinflusst. Wir nehmen daher an, dass das WRN Protein nur ausgewählte Endothelzellfunktionen reguliert. Da die WRN Helikase auch an der Reparatur von DNA-Basenschäden durch die Basenexzisionsreparatur (BER) beteiligt ist, wurde ebenfalls überprüft, ob eine Herunterregulation von BER Faktoren die nach WRN Herunterregulation beobachteten Effekte imitieren kann. In der Tat zeigte sich, dass spezifische BER Faktoren (insbesondere die Oxo-Guanin-DNA-Glykosylase, OGG1) für die Motilität endothelialer Zellen essentiell sind (APE1, PARP1) und auch die Expression endothelialer Zelladhäsionsmoleküle reprimieren können. Überraschenderweise haben verschiedene BER Faktoren jedoch unterschiedliche Wirkungen auf Endothelzellfunktionen. Die Befunde legen die Vermutung nahe, dass BER Proteine - neben ihrer DNA Reparaturfunktion - andere bislang unbekannte und DNA-Reparatur-unabhängige Funktionen in Endothelzellen haben, insbesondere im Zusammenhang mit entzündlichen Prozessen. Unerwartet war der Befund, dass WRN die endotheliale Homöostase lediglich unter basalen Bedingungen sicherstellt, nicht jedoch nach Exposition gegenüber höheren Konzentrationen exogener Noxen (Oxidantien, Alkylantien). In Bezug auf die gesunde Normalbevölkerung deuten die Resultate darauf hin, dass das individuelle Risiko für vaskuläre Alterungsprozesse und Arteriosklerose möglicherweise von der individuellen Höhe der Expression/Aktivität der WRN Helikase und/oder BER Faktoren beeinflusst wird., Möglicherweise sind Schwellenkonzentrationen/-aktivitäten der genannten Proteine erforderlich, um eine gesunde Endothelzellfunktionalität zu gewährleisten. Diese Arbeitshypothese könnte Ausgangspunkt für weiterführende Untersuchungen sein.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2019) Werner syndrome (WRN) DNA helicase and base excision repair (BER) factors maintain endothelial homeostasis, DNA Repair, 73, 17-27
Laarmann, K., Kress, J.M., Kaina, B., Fritz, G.
