Untersuchung von Strategien und Synergien in der DNA-Schadens-Erkennung mittels Einzelmolekül-AFM-Studien

• Antragstellerin: Dr. Ingrid Teßmer, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 254014264

Unser Erbmaterial wird kontinuierlich angegriffen und die Reparatur der entstehenden DNA-Schäden ist für die genomische Stabilität und damit die Lebensfähigkeit von Zellen unerlässlich. Unterschiedliche DNA-Schädigungen werden von einer Anzahl verschiedener DNA Reparaturmechanismen prozessiert. Wir untersuchen generische und spezifische Ansätze der Schadenserkennung in den verschiedenen Reparatur-Systemen mittels rasterkraftmikroskopischer (englisch atomic force microscopy, AFM) Einzelmolekül-Abbildungen. Unser Fokus liegt hierbei auf der Alkyl-Schadens-Reparatur durch die Alkyltransferase, AGT, und durch die vom katakytisch inaktiven AGT-Homolog ATL rekrutierte Nukleotid-Exzissions-Reparatur (NER). ATL induzierte NER von Alkyl-Schäden stellt eine interessante Alternative der Alkyl-Schadens-Prozessierung und neue Erweiterung des breiten NER Schadens-Spektrums dar. Ergänzend zu AFM-Messungen untersuchen wir kooperative Protein-DNA Wechselwirkungen mittels analytischer Ultrazentrifugtion insbesondere im Hinblick auf Unterschiede zu AGT, und direkte NER-Rekrutierung durch ATL mit Hilfe von Fluoreszenz-optische Pinzetten Kombinationstechnik. Der zweite Fokus dieses Antrags ist die generische Frage einer Struktur-basierten initialen Schadenserkennung durch die wichtigen Basenexzissionsreparatur DNA Glykosylasen. Unterstützend zu unseren strukturellen AFM Analysen an DNA-Schadenssubstraten führen wir Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) Messungen durch. Kontinuierliches DNA-Testen führt zu einem Gleichgewicht von Such-Komplex und Interrogations-Komplex-Konformationen, die unterschiedliche DNA-Biegungen aufweisen. Wir vermessen diese Biegungszustände von Glykosylase-DNA Komplexen mittels Einzelmolekül-FRET (smFRET) mit dSTORM und korrelieren sie mit strukturellen Eigenschaften der Schadens-Substrate in Abwesenheit von Protein. Die Synergien der AFM, Ensemble-FRET und smFRET Techniken eröffnen uns ein tieferes Verständnis der Rolle struktureller und mechanischer Eigenschaften von Glykosylase-Zielschäden in der initialen Schadenserkennung durch Glykosylasen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen