Strukturelle und funktionale Charakterisierung des regulativen Netzwerks der Plus-Enden von Mikrotubuli mittels Hybridmethoden

• Antragstellerin: Dr. Naoko Mizuno
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 254667228

Mikrotubuli sind äußerst dynamische Komponenten des Zytoskeletts. Sie stellen ein umfangreiches intrazelluläres Netzwerk dar, das für den Transport von Chromosomen, Vesikeln und Frachtproteinen zuständig ist. Sie zeichnen sich durch eine intrinsische Instabilität von abwechselnden Zyklen der Polymerisation und Depolymerisation aus, die von einer Reihe von Mikrotubuli-assoziierter Proteine (MAPs) gesteuert wird. +TIPs sind eine spezialisierte Gruppe von MAPs, die an den wachsenden Plus-Enden der Mikrotubuli akkumulieren und sie dadurch stabilisieren. Obwohl die grundlegenden Funktionen der +TIPs bereits untersucht wurden, sind die wesentlichen Mechanismen, wie +TIPs Mikrotubuli erkennen und deren Funktion regulieren, nur schlecht verstanden.Mit diesem Forschungsvorhaben soll ein Mitglied der +TIPs, p150glued oder Dynactin1, sowie seine Partnerproteine EB1 und CLIP-170 genauer untersucht werden. Es wurde gezeigt, daß diese Proteine Mikrotubuli stabilisieren und endosomale Vesikel an die Plus-Enden von Mikrotubuli rekrutieren. Wir beabsichtigen den molekularen Mechanismus der End-Erkennung sowohl durch p150glued (Projekt1) als auch durch den Komplex aus p150glued, EB1 und CLIP-170 (Projekt2) mit einer Kombination aus cutting-edge Hybridmethoden der Strukturanalyse (Kryo-Elektronenmikroskopie) zusammen mit biophysikalischen Techniken (Fluoreszenzmikroskopie und Spektroskopie) zu untersuchen. Die experimentelle Strategie folgt einem bottom-up Ansatz. Zunächst werden alle Partnerproteine aufgereinigt. Dann führen wir eine umfassende Untersuchung der einzelnen Komponenten und deren Interaktionen mit Mikrotubuli durch. Wir wollen 3D-Rekonstruktionen mittels KryoEM bis zu Subnanometer-Auflösung erstellen, um die molekularen Details der +TIPs-Interaktionen mit Mikrotubuli aufzudecken. Insbesondere sind wir an der Aufklärung der Rolle des Mikrotubuli-Erkennungsmotivs CAP-Gly in p150glued, CLIP-170 und anderer MAPs interessiert. Darüber hinaus werden wir verschiedene Komplexe der Interaktionspartner mit Mikrotubuli biochemisch sowie strukturell rekonstituieren, um deren funktionale Rolle zu charakterisieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen