Funktionelle Charakterisierung langer nicht-Protein-kodierender RNAs bei der Alzheimerschen Erkrankung

• Antragsteller: Professor Dr. Thomas Arendt
• Fachliche Zuordnung: Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 255009405

Vorliegendes Projekt setzt sich die Charakterisierung der spezifischen pathogenetischen Bedeutung langer, nicht-Protein kodierender RNA (lncRNA) bei der Alzheimerschen Erkrankung (AD) und deren Rolle im Prozeß der Neurodegeneration zum Ziel. Dazu sollen funktionell relevante lncRNA-Target Interaktionen für solche lncRNAs identifiziert und charakterisiert werden, die wir bereits in Vorversuchen als AD-assoziiert identifiziert haben. In unseren bisherigen Untersuchungen haben wir durch eine Kombination von tiling arrays und custom arrray platform (humBrainChip) an einer Kohorte von 40 AD Patienten und Gesunden das Genom-weite Muster von lncRNA Expressionsunterschieden zwischen Patienen und Gesunden etabliert. Durch enrichement Analysen und Abgleich mit tiling array Datensätzen von Zell-Zyklus-abhängig exprimierten lncRNAs, konnten 20 lncRNAs identifiziert werden, die eine Verbindung zu Chromatin-Assoziation, Zell-Zyklus-Regulation und AD zeigen, was unserer pathogenetisches Konzept gestörter epigenetischer Kontrolle von Zelldifferenzierung bei AD stützt. Ziel des Projektes ist die funktionelle Charakterisierung dieser 20 identifierten lncRNA mittels fünf aufeinander aufbauender experimenteller Schritte: (i) Identifizierung funktionell relevanter DNA und/oder RNA Target-Sequenzen mittels: Chromatin Isolation by RNA Purification-ChIRP (Chu et al. 2012; J Vis. Exp.; Mar. 25;(61). (ii) Identifizierung von lncRNA-abhängig regulierten DNA loci durch vergleichende Methylierungs- und Expressionsanalysen und deren Abgleich mit den in Vorarbeiten erhobenen Datensätzen zu AD-assozierten Expressionsänderungen (humBrainChip). (iii) RNA-bindende Proteine (RBP) sollen in zwei Schritten identifiziert werden. Zunächst wird die Beteiligung definierter Chromatin-assoziierter Proteine (z.B. Polycomb, HDAC, Histone, Methyltransferasen) mittels Antikörper überprüft. Ein systematischer proteomischer Ansatz zur Identifikation unbekannter RBPs wird Gegenstand des Antrags zur zweitern Förderphase sein. (iv) Die Wechselwirkungen lncRNAs und den identifizierten DNA-/RNA- und Protein-Bindungspartnern wird mittels spezifischer Bindungassays (z.B. EMSA) charakterisiert. (v) LncRNA-Target Interaktionen werden mittels esiRNA Technik im Hinblick auf ihre funktionelle Bedeutung für AD-assozierte molekulare Programme, wie Zell-Zyklus und Differenzierungskontrolle, Synaptogenese, Apoptose, Zelltod, Expression und Posttranslationale Modifikation von Amyloid Prekursor Protein und tau-Protein charakterisiert. Das Projekt soll zur Beantwortung folgender Fragen beitragen: (1) Sind lncRNA spezifisch in die pathophysiologische Dysregulation bei AD involviert, oder sind die beobachteten Veränderungen epiphenomenal? (2) Was sind die hierfür relevanten molekularen Targets der lncRNAs? (3) Wie ist der Funktionsmechanismus der hierbei beteiligten lncRNAs und in welcher Weise führt dieser zu Zelltod und Neurodegeneration?

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1738: Neue Funktionen von nicht kodierenden Ribonukleinsäuren während der Entwicklung, Plastizität und Erkrankung des Nervensystems