Prozessierung und Funktion des Gp2/3/4 Spikeproteins des porcinen Reproduktiven und Respiratorischen Syndrom Virus (PRRSV)

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Michael Veit
• Fachliche Zuordnung: Tiermedizin
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 256219832

Arteriviridae sind eine Familie von umhüllten RNA Viren, die, trotz ihrer veterinärmedizinischen Bedeutung, nur unzureichend erforscht sind. Das equine Arteritis Virus (EAV) ist der Prototyp der Familie, während das porcine Reproduktive und Respiratorische Syndrom Virus (PRRSV) der wichtigste Schaderreger in Schweinebeständen ist. PRRSV verursacht persistierende Infektionen, die, neben der hohen Variabilität der Glykoproteine, als Haupthindernis gilt, das Virus aus Schweinebeständen zu eliminieren. Eine molekulare Ursache der Persistenz ist das späte Auftreten von neutralisierenden Antikörpern, aber deren Zielproteine wurden noch nicht identifiziert.Die Lipidmembran der Arteriviren enthält zwei Glykoprotein-Spikes, Gp5/M und Gp2/3/4, die in Zellen im ER oder im cis-Golgi zurückgehalten werden, wo die Assemblierung von Viruspartikeln erfolgt. Experimente mit rekombinanten Viren zeigen, dass Gp5/M für das Virusbudding und Gp2/3/4 für den Zelleintritt erforderlich sind. Der Disulfid-verknüpfte Gp2/3/4 Komplex wird durch einen komplizierten und weitgehend unverstandenen Prozess assembliert. Während Gp2 und Gp4 eine Disulfidbrücke im ER ausbilden, wird die Disulfidbrücke zwischen Gp3 und Gp2/4 erst in Viruspartikeln geknüpft. Unsere Arbeiten mit EAV zeigten ein weitere Besonderheit von Gp3: eine N-Glykosylierung in der Nachbarschaft des Signalpeptides hemmt dessen Spaltung. Dies führte auch zu einem neuen Model für die Membrantopologie von Gp3: Das ungespaltene Signalpeptid dient nicht als Membrananker, sondern wird vollständig in das Lumen des ER transloziert. Die Verankerung bewirkt der hydrophobe C -Terminus, der Gp3 peripher an Membranen befestigt.Mit diesem Projekt wollen wir nicht nur die Assemblierung des Gp2/3/4 Spikes aufklären, sondern auch ein Werkzeug herstellen, um dessen Funktion zu analysieren. Wir werden zuerst untersuchen, ob Gp3 aus verschiedenen PRRSV-Stämmen dem gleichen Prozessierungsschema folgt und die gleiche Membrantopologie besitzt wie Gp3 von EAV. Interessanterweise unterscheiden sich PRRSV-Stämme in den biophysikalischen Eigenschaften des C -Terminus von Gp3, was darauf hindeutet, dass in einigen Stämmen das Protein möglicherweise von Zellen sekretiert wird. Mittels reverser Genetik wird die Bedeutung der Membranverankerung von Gp3 für die Infektiosität der Viren analysiert. Wir werden dann einen nativen Gp2/3/4 Komplex in transfizierten Zellen aus seinen Komponenten assemblieren. Durch Deletion von Retentionssignalen, die bisher nicht identifiziert wurden, aber vermutlich in der Transmembranregion der Proteine lokalisiert sind, soll der Komplex an die Plasmamembran gesteuert werden. Ein an der Zelloberfläche lokalisierter Gp2/3/4 Spike ist zugänglich für eine Vielzahl von Untersuchungsmethoden, wie die Bindung an zelluläre Rezeptoren und an Antikörper sowie für Membranfusionsassays und ermöglicht somit, die Rolle des Gp2/3/4 Spikes beim Viruseintritt und als mögliche Angriffspunkt von Antikörpern aufzuklären.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen