Durchflusszytometer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Durchflusszytometer ist seit seiner Beschaffung im Dezember 2014 zentral in alle unsere Arbeiten mit Caenorhabditis elegans eingebunden. Sämtliche transgenen Tiere, die extrachromosomale Arrays enthalten (z.B., um GFP-, RFP- oder mCherry-gekoppelte Chaperone oder Modellsubstrate zu exprimieren), werden routinemäßig mit dem Durchflusszytometer gescreent, um Revertanten auszusortieren und nachfolgend biochemische Analysen verschiedenster Art ohne Hintergrund durchzuführen; dazu gehört Alles vom Immunoblot bis hin zu Ribosomenanalysen. In Kürze nur die wichtigsten Ergebnisse, die mit Hilfe dieses Gerätes erhalten und bereits publiziert wurden. Eine große zentrale Frage in meinem Forschungsgebiet ist, welche Rolle(n) der in Eukaryonten hochkonservierte Chaperon-Komplex NAC (nascent polypeptide-associated complex) in der zellulären Proteostase spielt. NAC bindet transient ans Ribosom und ist mit naszierenden Polypeptidketten quervernetzbar. Über zwei Jahrzehnte hinweg war aber ungeklärt, welche Funktion NAC nun tatsächlich ausübt. Durch Analysen von GFP-gekoppelten Modellproteinen in C. elegans haben wir in vivo gezeigt, dass Ribosomen-assoziiertes NAC eine essenzielle Rolle bei der korrekten Sortierung von neu synthetisierten Proteinen in der Zelle hat. NAC bindet am Tunnelausgang des Ribosoms und verhindert so die unspezifische Assoziation von Ribosomen mit dem ER-Translokon. Fehlt NAC, so kommt es zum Fehlimport von mitochondrialen Proteinen ins Endoplasmatische Retikulum (ER). Das löst Stress im ER und in Mitochondrien aus und führt zu einer um 50% verkürzten Lebensspanne dieser Tiere. Zahlreiche transgene Tiere wurde für diese Publikation mittels Durchflusszytometer gescreent. Zahlreiche neurodegenerative Erkrankungen stehen im Zusammenhang mit Proteinfaltungsdefekten, z.B die Parkinson-Erkrankung, die durch aggregierendes alpha--Synuclein- Protein ausgelöst wird. Einige Chaperone können in diesen Aggregationsprozess eingreifen oder ihn sogar revertieren. Völlig unklar war bislang, ob NAC eine solche Funktion besitzt. In einer Studie zusammen mit Sheena Radford (University of Leeds) haben wir transgene C. elegans-Tiere, die fluoreszenzmarkiertes alpha-Synuclein produzieren, mittels Durchflusszytometer gescreent und sowohl biochemisch als auch mit konfokaler Laserscanningmikroskopie analysiert. Die Depletion von NAC führte zur deutlichen Verstärkung der Aggregation von alpha-"Synuclein. Demnach ist NAC direkt oder indirekt wichtig, um alpha-Synuclein in den Zellen löslich zu halten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2015) The principle of antagonism ensures protein targeting specificity at the endoplasmic reticulum. Science 348, 201-207
Gamerdinger, M., Hanebuth, M.A., Frickey, T., and Deuerling, E.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1126/science.aaa5335) - (2018) Conformational flexibility within the nascent polypeptideassociated complex enables its interactions with structurally diverse client proteins. J. Biol. Chem. 293, 8554-8568
Martin, E.M., Jackson, M.P., Gamerdinger, M., Gense, K., Karamanos, T.K., Humes, J.R., Deuerling, E., Ashcroft, A.E., and Radford, S.E.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1074/jbc.RA117.001568)
