DNA-Replikation der beiden Vibrio cholerae Chromosomen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Bakterien tragen ihre genetische Information in der Regel auf einem einzigen Chromosom, während beispielsweise menschliche Zellen jeweils 23 verschiedene Chromosomen tragen. Das Bakterium Vibrio cholerae und eigentlich alle bisher bekannten Vibrio-Stämme tragen zwei Chromosomen, was sie in dieser Hinsicht zu einer Ausnahme in der Welt der Bakterien macht. Eine grundlegende wissenschaftliche Frage, die sich aus dieser Zwei-Chromosomen- Konstellation ergibt, ist, wie die Replikation der beiden Chromosomen koordiniert wird. In der Vergangenheit wurde festgestellt, dass die Replikation einer kurzen DNA-Sequenz auf Chromosom 1 (Chr1), genannt crtS, den Start der Replikation von Chromosom 2 (Chr2) auslöst. Das Ziel dieses Projekts war es, diese interchromosomale Kommunikation besser zu verstehen. Ein wichtiges Ziel war es, die funktionalen Teile der crtS Sequnz zu definieren. Zu diesem Zweck haben wir eine völlig neue Methodik entwickelt, um Tausende von systematisch variierten crtS-Sequenzen zu testen und funktionelle von nicht-funktionellen Sequenzen zu unterscheiden. Es ist uns gelungen, das allgemeine Verfahren zu etablieren und eine erfolgreiche Selektion zu zeigen. Allerdings muss die Sequenzbibliothek optimiert werden, um den gesamten Sequenzraum abzudecken. Die Position von crtS auf Chr1 ist entscheidend, da sie den Zeitpunkt des Beginns der Replikation von Chr2 bestimmt. Um zu sehen, wie streng diese Lokalisierung ist oder wie viel Abweichung vom Original toleriert wird, haben wir eine Methodik entwickelt, um dies experimentell zu testen. Zu diesem Zweck haben wir ein synthetisches transponierbares Element mit einem implementierten Reporter entworfen, konstruiert und getestet, um erfolgreiche Transpositionsereignisse auszuwählen. Wir konnten zeigen, dass das System im Allgemeinen funktioniert. Die Abstimmung der Transposaseaktivität ist jedoch in diesem Aufbau entscheidend und erfordert weitere Optimierungen. Um einen Einblick in die evolutionäre Konservierung der Position der crtS-Stelle zu erhalten, haben wir uns mit Kollegen der Deutschen Stammsammlung (DSMZ) in Braunschweig zusammengetan, um etwa 200 Vibrio-Genome zu sequenzieren, für die eine Sequenz fehlte. Wir fanden heraus, dass die Position von crtS auf Chr1 konsistent mit der Größe des jeweiligen Chr2 in den jeweiligen Stämmen zusammenhängt, was mit der funktionellen Bedeutung der Position übereinstimmt. Unser Forschungsthema ist von großem Interesse, und mehrere Forschungsgruppen auf der ganzen Welt tragen dazu bei, die zugrunde liegenden Mechanismen aufzudecken. Während der Förderperiode dieses Projekts nutzte eine Gruppe von Forschern in Frankreich eine von uns kürzlich entwickelte Technologie, um ähnliche Experimente wie die in unserem Antrag vorgeschlagenen durchzuführen, um die regulatorischen Ereignisse der Chr2-Replikation in zeitlicher Auflösung zu bestimmen.
