Zelluläre Aufnahme der Rho aktivierenden Toxine CNF1 und CNFY und anderer Deamidasen

• Antragstellerin: Professorin Dr. Gudula Schmidt
• Fachliche Zuordnung: Pharmakologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 261620687

Meine Arbeitsgruppe beschäftigt sich seit vielen Jahren mit bakteriellen Toxinen (Deamidasen), die Rho GTPasen oder die Gα-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine dauerhaft aktivieren. Charakterisiert wurden mittlerweile 5 Mitglieder der CNF Proteinfamilie (Cytotoxisch Nekrotisierende Faktoren 1, 2, 3 und CNFY, sowie CNFS) die von pathogenen Escherichia coli, Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) und Salmonella enterica (CNFS) produziert werden, Pasteurella multocida Toxin (PMT) und Bordetella Dermo-Nekrotisches Toxin (DNT). Neben dem Molekularen Mechanismus, ist das Wissen um die Zellspezifität (zellulärer Rezeptor) und der Aufnahmeweg in Säugerzellen entscheidend, um diese wertvollen molekularen Werkzeuge zellbiologisch nutzen oder pharmakologisch inhibieren zu können.Zur Identifizierung von zellulären Membranproteinen, die für die Aufnahme der Toxine von Bedeutung sind, wurde bisher versucht, Interaktionspartner mit biochemischen Methoden zu reinigen. Einige Toxin-Rezeptoren wurden auch tatsächlich identifiziert, z.B. Lu/BCAM (Lutheran/ Basal Cell Adhesion Molecule) als Bindungspartner von CNF1 Wir haben darüber hinaus auch Proteoglycane als „landing platform“ für die Protein-Toxine charakterisiert. Für eine effektivere und zielgerichtete Suche nach zellulären Rezeptoren haben wir mittlerweile eine neue Methode etabliert, die durch Gen-knockout Toxin-resistente Zellen erzeugen kann. Dazu nutzen wir eine lentivirale CRISPR/Cas9 basierte knockout Bibliothek, mit deren Hilfe statistisch ein Gen pro Zelle unwirksam gemacht werden soll. Wir haben bereits zwei stabil Cas9 exprimierende Maus-Zelllinien hergestellt, in welchen unsere Bibliothek eingesetzt werden kann. Mit dem chimären Toxin PMT-DTA (katalytische Domäne des Diphtherietoxins) wurden die ersten drei CRISPR Screens bereits durchgeführt und folgende interessante Zielgene identifiziert: Zwei Gene für die Diphthamid Biosynthese (Zielaminosäure von DTA, zeigt die Funktionalität des Screens), LDL Rezeptor Related Protein 1 (LRP1) und die Oligosaccharyltransferase Komplex Untereinheit (Ostc). LRP1-knockout Zellen zeigen sich in ersten Versuchen resistent gegen PMT-DTA. Die Relevanz von LRP1 und Ostc für die Zellbindung und Aufnahme soll analysiert und die genaue Interaktionsstelle zwischen PMT und Rezeptor identifiziert werden. Die erstellte Screening Methode soll zur Identifizierung weiterer Toxin-Rezeptor Paare genutzt werden, insbesondere wollen wir den Rezeptor von Yersinia CNFY bestimmen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen